血清外泌体抽提方法y

mirexosome

1.        For the isolation of exosomes from human umbilical cord Wharton’s jelly-MSCs and human dermal fibroblasts, serum-free culture medium conditioned for 24 hours was filtered (0.2 m) and concentrated by ultrafiltration device with 100-kDa cutoff (Millipore).
   2.Exosomes in CM were precipitated with one-third volume of polyethylene glycol buffer (33.4% PEG 4000, 50 mmol/L HEPES [pH 7.4], 1 mol/L NaCl) overnight at 4°C, followed by centrifugation at 12 000 g for 5 minutes and resuspension in PBS (pH 7.4).
   3.Exosomes in polyethylene glycol–precipitated fraction were further purified by S200 size-exclusion chromatography. A 75-L sample was applied on a S200 column (Clontech, Mountain View, CA)pre-equilibrated with PBS by spinning at 700 g for 5 minutes, and the exosomal fraction was subsequently eluted in the flow-through by centrifugation at 700 g for 5 minutes.

楼主按zhuyiping的说法，去做的话，你上面的这些要用的东西怎么解决呢？有些压根毒不知道是什么

暮色恭喜发财

mirexosome 发表于 2015-8-8 23:02
1.        For the isolation of exosomes from human umbilical cord Wharton’s jelly-MSCs and human dermal fi ...

ultrafiltration device with 100-kDa cutoff (Millipore)，这就是一个浓缩管
PEG 4000, 50 mmol/L HEPES [pH 7.4]这些也是常用试剂呀
至于后续要不要纯化在看。

mirexosome

暮色恭喜发财 发表于 2015-8-10 10:29
ultrafiltration device with 100-kDa cutoff (Millipore)，这就是一个浓缩管
PEG 4000, 50 mmol/L HEP ...

好的，等你的结果

mirexosome

暮色恭喜发财 发表于 2015-8-7 14:01
现在的主要问题是弄清楚是PEG多少好，还有就是在哪个缓冲液中好，还有就是PH值 ...

楼主实验进行的怎么样，是否理想，请分享下……

暮色恭喜发财

mirexosome 发表于 2015-8-12 16:55
楼主实验进行的怎么样，是否理想，请分享下……

现在还在摸索条件，主要是抽提出来不好检测，沉淀是有的，看表型还可以

mirexosome

暮色恭喜发财 发表于 2015-8-13 11:23
现在还在摸索条件，主要是抽提出来不好检测，沉淀是有的，看表型还可以 ...

不好检测是什么意思?有表型是指在扫描电镜下看得到exosome吗？

暮色恭喜发财

mirexosome 发表于 2015-8-14 10:12
不好检测是什么意思?有表型是指在扫描电镜下看得到exosome吗？

我们看到了沉淀，但不知道我们检测到的是是什么，准备用试剂盒来检测，有结果我在公布

jianwen

暮色恭喜发财 发表于 2015-8-7 13:41
我们就是用的SBI的，20ml的要11000，太贵。

请问一下你是用多少血清分离外泌体，我是打算做miRNA芯片的

暮色恭喜发财

我们现在用的跟试剂盒是一样的，250ul或者500ul.

evomicscience

Peg 4000 至20000，终浓度5-10%都可以。用它分离血清exosome会有很多问题。