PKH67染色

wanghx_85

惜名 发表于 2015-12-16 12:05
1、提取外泌体，用SBI的exoquick。
2、提取后按照那篇JCI的步骤染色PKH67，此时染的是exo
3、染色结束后 ...

谢谢惜名版主，太感动了，没想到您秒回啊，能否再简单说下先染后提的方法，其实我就是想知道有没有省点儿SBI试剂的方法啊

惜名

wanghx_85 发表于 2015-12-16 12:09
谢谢惜名版主，太感动了，没想到您秒回啊，能否再简单说下先染后提的方法，其实我就是想知道有 ...

啊，省试剂啊，哈哈~
1、提取exo的时候可以先用Millipore的管子浓缩一下
2、用PKH67染色的时候，PBS-exo以及Dilute C都可以适当减量，后面加的BSA中和液也可以减量，把最后总的体积控制在0.6-1.0ml效果还是不错的。

wanghx_85

惜名 发表于 2015-12-16 12:12
啊，省试剂啊，哈哈~
1、提取exo的时候可以先用Millipore的管子浓缩一下
2、用PKH67染色的时候，PBS-exo ...

跪谢惜名版主，非常感谢。

惜名

wanghx_85 发表于 2015-12-16 22:54
跪谢惜名版主，非常感谢。

不用谢

wanghx_85

惜名 发表于 2015-12-17 08:49
不用谢

呼叫惜名版主，那个外泌体染色、重提、PBS重悬后，一般加多少ul至靶细胞中共培养呢？假设24孔板做的话，谢谢版主

惜名

wanghx_85 发表于 2015-12-18 00:00
呼叫惜名版主，那个外泌体染色、重提、PBS重悬后，一般加多少ul至靶细胞中共培养呢？假设24孔板做的话， ...

这个要自己摸索浓度了。我做过6和12孔板，一般加30-100ul都可以获得满意结果。但是，也要根据你获得exo的量的，如果获得的exo很少，你用200ul重悬，那或许浓度就太低了。。。

wanghx_85

惜名 发表于 2015-12-18 08:44
这个要自己摸索浓度了。我做过6和12孔板，一般加30-100ul都可以获得满意结果。但是，也要根据你获得exo的 ...

哦，嘻嘻，版主，问题又来了，操作过程是否需要避光呢？请版主大人原谅小的无知，问题多多哈

wanghx_85

惜名 发表于 2015-12-18 08:44
这个要自己摸索浓度了。我做过6和12孔板，一般加30-100ul都可以获得满意结果。但是，也要根据你获得exo的 ...

惜名版主，根据您的指导，我写了个大概的染色步骤，请您再帮忙指导下看我的理解是否正确：
1、SBI提取外泌体，PBS重选EXO
2、PBS-EXO+1mlDiluent C混匀
3、4ul PKH67 + 1ml Diluent C混匀
4、将步骤3的试剂加入步骤2的液体中，4min
5、2ml BSA 终止染色
6、SBI试剂重提EXO
（注：试剂可按比例适当减量）
问题：整个操作过程是否需要避光？

惜名

wanghx_85 发表于 2015-12-18 23:52
惜名版主，根据您的指导，我写了个大概的染色步骤，请您再帮忙指导下看我的理解是否正确：
1、SBI提取外 ...

对的，是这样的步骤。
根据SBI官方的说明，如果你能把最终的体积控制在0.5ml，然后加入0.1ml的ExoQuick，只需要冰上静置0.5小时，然后12000rpm*4min离心，就可以获得exosome了。
在实际操作中，我会尽量把最终的总量控制在0.6ml，然后加入1/5体积的ExoQuick，4度静置40-60min，然后12000rpm*4min离心。

嗯，理论上最好避光，因为PKH67是荧光染料。但是操作过程其实非常短。只需要十几分钟，所以我都没避光。4度静置的时候是避光的。

wanghx_85

惜名 发表于 2015-12-19 09:28
对的，是这样的步骤。
根据SBI官方的说明，如果你能把最终的体积控制在0.5ml，然后加入0.1ml的ExoQuick， ...

最终总量控制在0.5ML？有难度呀，版主，你看PBS重悬的EXO有100ul，按您说的降低试剂比例来的话，稀释液C 0.3ml至PBS-EXO中，然后配2X染色液：PKH-67中再加0.3ML，两者一混合就有0.7ML了，再加上终止反应的BSA 0.7ML，那就有1.4ML了呀？谢谢版主不厌其烦为我解答。