PKH67染色

惜名

wanghx_85 发表于 2015-12-19 22:31
最终总量控制在0.5ML？有难度呀，版主，你看PBS重悬的EXO有100ul，按您说的降低试剂比例来的话，稀释液C  ...

我都是直接把0.4ul PKH67加入“PBS-EXO-稀释液”的~

wanghx_85

惜名 发表于 2015-12-20 09:40
我都是直接把0.4ul PKH67加入“PBS-EXO-稀释液”的~

好的，版主，准备明天试试了，早就该做了，却因为各种原因拖了这么久，谢谢惜名版主连日来的悉心指导，等我实验一次，再来向版主请教。跪谢1

wanghx_85

惜名 发表于 2015-12-20 09:40
我都是直接把0.4ul PKH67加入“PBS-EXO-稀释液”的~

惜名版主，做了几次失败了，哎，现在都好烦躁，觉得这个外泌体太难做了，为啥我连外泌体都染不上呢？我染了血清外泌体没荧光，染了细胞培养上清外泌体没荧光，是因为我没在25度环境下么？版主，怎样保证25度呢？PKH67放少了？我也是按照你的0.4ul做的呢？提的外泌体有问题？用的SBI试剂提的，鉴定过的啊？血清放的时间久了？-80度两个月，应该没问题吧？细胞培养上清是先提先做的啊，版主大人能够用您丰富的经验为小的解答一下

惜名

wanghx_85 发表于 2016-1-14 12:07
惜名版主，做了几次失败了，哎，现在都好烦躁，觉得这个外泌体太难做了，为啥我连外泌体都染不上呢？我染 ...

失败了是啥意思？具体讲讲在哪一步出了问题？
我前天又染了一次，很成功啊，步骤不复杂，也不需要完全25度，室温就可以了。

wanghx_85

我也不知道哪里出问题了，提了外泌体之后我就用100ulPBS重悬，然后开始PKH67染色，方法是：100ul Diluent C加入PBS-EXO中，然后0.4ul PKH 67 加入100ulDiluent C中，然后将两者混合4分钟，最后200ul0.5%BSA终止反应，最后再重提Exo，加入24孔板中，加完之后我就用荧光显微镜看了下，什么都看不到啊。我在问一下，版主，最后染了色的外泌体和靶细胞共培养一段时间后，是直接4%多聚甲醛固定，然后染核就可以了噻？没啥特殊的步骤吧

wanghx_85

惜名 发表于 2016-1-15 08:48
失败了是啥意思？具体讲讲在哪一步出了问题？
我前天又染了一次，很成功啊，步骤不复杂，也不需要完全25 ...

再补充下，外泌体提取试剂盒是SBI的，PKH67是Sigma的，BSA比较屌丝，是碧云天花10块钱买的，请版主帮我分析下问题在哪儿？唉，我这个科研屌丝在这条路上越走越远，越陷越深，真不知道什么时候是个头啊

wjy

wanghx_85 发表于 2016-1-21 11:59
我也不知道哪里出问题了，提了外泌体之后我就用100ulPBS重悬，然后开始PKH67染色，方法是：100ul Diluent C ...

我也做过这个实验，也是sigma的pkh26(红色膜染料)。我是先取1ulpkh26膜染料与100ulexo先孵育增加结合效率，然后加入1ml的 Diluent C，加入200ul1%BSA/PBS（我理解的加入200ul1%BSA/PBS的目的不是的终止反应，是增加连接效率，封闭非特异性的）。然后再体系中加入3ul的PKH26染料室温孵育20min,1h20min,10,0000g超速离心。获得的沉淀用100ul重悬。标记好的exo与细胞共孵育后再共聚焦显微镜下可以看到exo uptake cell

惜名

wanghx_85 发表于 2016-1-21 12:10
再补充下，外泌体提取试剂盒是SBI的，PKH67是Sigma的，BSA比较屌丝，是碧云天花10块钱买的，请版主帮我分 ...

你染后用SBI重提离心结束能看到黄色沉淀么？如果能，那说明染色没问题的，如果不能，那就悲剧了。
如果染色没问题，摄取实验看不到绿光，还有可能是细胞没摄取啊。。。

wanghx_85

惜名 发表于 2016-1-21 16:35
你染后用SBI重提离心结束能看到黄色沉淀么？如果能，那说明染色没问题的，如果不能，那就悲剧了。
如果染 ...

沉淀是什么颜色的我还没注意呢，下周再做再看，版主，您用的是什么孔板做摄取实验（12孔还是6孔？）？每个孔种多少细胞？加入染色的EXO后又共培养多久（24h or 48h）？

wanghx_85

wjy 发表于 2016-1-21 15:01
我也做过这个实验，也是sigma的pkh26(红色膜染料)。我是先取1ulpkh26膜染料与100ulexo先孵育增加结合效率 ...

我提取EXO的方法不是超速离心，是SBI试剂盒呢，我以后也按照您的方法做一次，难道是分细胞系，孵育的时间短了？