大家关于试剂盒的几点疑问和澄清

ucsandiego

hzangs 发表于 2017-7-31 09:41
thermo 收购了 invitrogen       life 收购了 thermo

哦 好，但是我查到的新闻都是说thermo收购了life啊。。不过反正就是invitrogen那种试剂盒吧，Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media)就是这个，瓶子的商标是invitrogen把，因为最近要开展外泌体相关试验，所以在了解这些试剂盒，谢啦

ucsandiego

hzangs 发表于 2017-7-31 09:41
thermo 收购了 invitrogen       life 收购了 thermo

还得请教您一个问题，在一个帖子中听说您用qev的柱子提取外泌体得到了较好的结果，我想问下qev用得到超离吗？还有这种方法是不是提取的外泌体杂蛋白较少，也就是说会比SBI的试剂盒好些呢，谢啦

ucsandiego

ucsandiego 发表于 2017-7-31 12:03
哦 好，但是我查到的新闻都是说thermo收购了life啊。。不过反正就是invitrogen那种试剂盒吧，Total Exoso ...

哈哈，又来了，我想得到较纯的外泌体（不含杂蛋白），qev这个试剂盒是不是就是一个柱子啊（我现在研一，没怎么接触过这方面的实验，见谅），会不会用到其他什么仪器呢，我刚才查了下这个产品，原理就是一个70nm的孔，可以把比外泌体小的杂蛋白过滤掉，也就是说如果我先用sbi试剂盒得到外泌体，在用qev纯化就可以得到较纯的外泌体了吗，多谢师兄哈，我这面没人做过外泌体，只能在网上请教大家了，多谢啦

hzangs

ucsandiego 发表于 2017-7-31 12:31
哈哈，又来了，我想得到较纯的外泌体（不含杂蛋白），qev这个试剂盒是不是就是一个柱子啊（我现在研一， ...

老老实实超离吧。  别的都不是很靠谱

ucsandiego

hzangs 发表于 2017-8-1 11:31
老老实实超离吧。  别的都不是很靠谱

好的，多谢师兄，我现在再查超离的protocol，有什么靠谱的文献给推荐下呗，还有师兄我加入你说的那个qq群了，还没同意我加入呢，求批准

gj417439623

各位前辈，刚开始接触外泌体，我想用人的血清提取外泌体，后面涉及RNA和蛋白质测序，暂时不涉及更深入机制。这样的话到底是选超离法呢还是试剂法合适呢？然后，除了SBI的EXOquick试剂盒，我还看到有人用Qiagen 的kit试剂盒，请问这两种方法是否都是基于PEG沉淀法的？那是不是杂蛋白就比较多了？
还有，之前各位前辈的讨论我都看了，一直再说的那个 粒径/蛋白 的这个值，是用nanosight鉴定得到的是么?这个值更体现exosome的纯度么？
谢谢前辈！

wangjiachen

gj417439623 发表于 2017-8-23 17:18
各位前辈，刚开始接触外泌体，我想用人的血清提取外泌体，后面涉及RNA和蛋白质测序，暂时不涉及更深入机制 ...

请问楼主，你的问题解决了么？你最后订的什么试剂盒，结果怎么样呢？

gj417439623

wangjiachen 发表于 2017-11-6 11:13
请问楼主，你的问题解决了么？你最后订的什么试剂盒，结果怎么样呢？

没有 现在才刚开始做了预实验 选择了超离法  还有很多问题

lunan3067280

PEG沉淀，包括商品化的试剂盒有缺点，但是可以避免的。有些楼层说PEG沉淀出来一大坨沉淀，当你用无血清的培养上清加PEG沉淀是绝对看不到的，之前有文献已经说明了，exo-free 血清的培养基里面有大量的脂蛋白，  如果加PEG沉淀出来的必然是那一大坨脂蛋白。再次我不建议使用exo-free的血清培养基，你用超离，用SEC也会将带有脂蛋白污染，用PEG更不行。
PEG适用于无血清培养基的小囊泡分离。 首先无血清培养基里面只有小分子化合物，经过细胞培养后，细胞分泌的物质主要是小蛋白以及各种囊泡，除非细胞特异，一般不会有脂蛋白产生。及时PEG能够把左右的东西沉淀下来，其中物质包括了囊泡和小蛋白。   那么我们可以通过方法减少小蛋白的污染，这时候用到的就是超滤。功能性的小蛋白主要都是50KDa以下，细胞因子，趋化因子都在10kD左右，你用100KD，甚至300KD 等的超滤管浓缩后，大量的小蛋白被除去，如果在浓缩后加上PBS洗，再浓缩，理论上可以将小蛋白基本除去，毕竟你用的100kD的滤膜，除非堵塞很严重。上面在某些步骤加上0.22过滤。

当你把小蛋白除去以后，在用PEG沉淀，这时候沉淀的主要就是小囊泡，期间可能会有一些蛋白聚合物，但是细胞培养一般不会分泌太大的大分子蛋白，聚合起来也不会特别大。 所以得到的囊泡是比较纯的。  除非有人告诉我你无血清里面还有其他我没提到的物质。

我建议大家都不要在使用exo-free的血清培养基来分离外泌体，里面太多的脂蛋白了，通过超离是离心不完全的，特别是用任何沉淀法的时候。

总之，PEG可以沉淀下来蛋白，那么我们提前避免培养上清里面有过多的蛋白，并且预先讲其除去呢？那样沉淀下来的不就是我们想要的了么！ 上面所说的细胞都是以不产生病毒颗粒的细胞。

dongdongdong

william 发表于 2017-3-31 22:40
建议你德国ZetaView看一下你用试剂盒得到外泌体的浓度、颗粒粒径、杂质情况。 ...

看文献上都是用的nanosight,德国ZetaView怎么样呢