大家关于试剂盒的几点疑问和澄清

wangjiachen

gj417439623 发表于 2017-8-23 17:18
各位前辈，刚开始接触外泌体，我想用人的血清提取外泌体，后面涉及RNA和蛋白质测序，暂时不涉及更深入机制 ...

请问楼主，你的问题解决了么？你最后订的什么试剂盒，结果怎么样呢？

gj417439623

wangjiachen 发表于 2017-11-6 11:13
请问楼主，你的问题解决了么？你最后订的什么试剂盒，结果怎么样呢？

没有 现在才刚开始做了预实验 选择了超离法  还有很多问题

lunan3067280

PEG沉淀，包括商品化的试剂盒有缺点，但是可以避免的。有些楼层说PEG沉淀出来一大坨沉淀，当你用无血清的培养上清加PEG沉淀是绝对看不到的，之前有文献已经说明了，exo-free 血清的培养基里面有大量的脂蛋白，  如果加PEG沉淀出来的必然是那一大坨脂蛋白。再次我不建议使用exo-free的血清培养基，你用超离，用SEC也会将带有脂蛋白污染，用PEG更不行。
PEG适用于无血清培养基的小囊泡分离。 首先无血清培养基里面只有小分子化合物，经过细胞培养后，细胞分泌的物质主要是小蛋白以及各种囊泡，除非细胞特异，一般不会有脂蛋白产生。及时PEG能够把左右的东西沉淀下来，其中物质包括了囊泡和小蛋白。   那么我们可以通过方法减少小蛋白的污染，这时候用到的就是超滤。功能性的小蛋白主要都是50KDa以下，细胞因子，趋化因子都在10kD左右，你用100KD，甚至300KD 等的超滤管浓缩后，大量的小蛋白被除去，如果在浓缩后加上PBS洗，再浓缩，理论上可以将小蛋白基本除去，毕竟你用的100kD的滤膜，除非堵塞很严重。上面在某些步骤加上0.22过滤。

当你把小蛋白除去以后，在用PEG沉淀，这时候沉淀的主要就是小囊泡，期间可能会有一些蛋白聚合物，但是细胞培养一般不会分泌太大的大分子蛋白，聚合起来也不会特别大。 所以得到的囊泡是比较纯的。  除非有人告诉我你无血清里面还有其他我没提到的物质。

我建议大家都不要在使用exo-free的血清培养基来分离外泌体，里面太多的脂蛋白了，通过超离是离心不完全的，特别是用任何沉淀法的时候。

总之，PEG可以沉淀下来蛋白，那么我们提前避免培养上清里面有过多的蛋白，并且预先讲其除去呢？那样沉淀下来的不就是我们想要的了么！ 上面所说的细胞都是以不产生病毒颗粒的细胞。

dongdongdong

william 发表于 2017-3-31 22:40
建议你德国ZetaView看一下你用试剂盒得到外泌体的浓度、颗粒粒径、杂质情况。 ...

看文献上都是用的nanosight,德国ZetaView怎么样呢

WinterBlinder

感谢分享，收获很大