加州大学伯克利分校：细胞是如何分选miRNAs进入exosomes的？

Johnny

外泌体是后生动物细胞分泌的小囊泡，并且可以传送选定的膜蛋白和小RNAs到靶细胞控制细胞的迁移、发展和转移。为了研究RNA包装进外泌体的机制，来自加州大学伯克利分校的研究人员设计了基于膜标记CD63分离HEK293T细胞分泌的单一类型外泌体的纯化方案。使用免疫分离的含CD63外泌体，确定了一组相对于它们的细胞水平高度富集的miRNAs。探索外泌体生物形成和RNA包装的生化要求，研究人员设计了一种无细胞反应体系，可再现在补充有细胞溶质的分离膜选择性包装miR-223的现象。研究发现，RNA结合蛋白Y-box protein I（YBX1）可结合miR-223并对miR-223在无细胞反应体系中的分选必不可少。此外，YBX1在HEK293T细胞分泌miRNAs进外泌体中起重要作用。

文章思路：首先，利用超速离心分离得到exosome pellet，然后将pellet重悬与60%蔗糖中，再用CD63抗体纯化exosome。Protocol如下，

超离的exosome与超离后再用蔗糖重悬CD63纯化exosome电镜图如下，差异还是挺大的，超离的exosome有明显的聚团现象。

接着证明分离的exosome中含有RNA，

Exosome中富含特定的miRNAs，

建立exosome形成的无细胞反应体系

无细胞反应体系可选择性包装miRNAs进exosome

通过质谱分析得出YBX1可能参与miRNAs包装进exosome

常见的miRNAs结合蛋白Ago2并不参与miRNAs包装进exosome

最后利用CRISPR/CAS9靶向YBX1突变方法证明YBX1对于外泌体miRNAs的包装和分泌是必需的

参考文献：

Shurtleff, M. J., et al. (2016). "Y-box protein 1 is required to sort microRNAs into exosomes in cells and in a cell-free reaction." Elife 5.  IF=8.303

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