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关于SBI试剂提取Exo, 如何浓缩细胞上清

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发表于 2016-10-6 23:40:08 | 显示全部楼层 |阅读模式
看坛子里不少同学提到用kit提取exo之前,可以用超滤管浓缩一下,那想请教做过的同学几个问题哈1.使用100kd的管子吗,多少转离心多久,这个有protocol吗?
2.一般是用10ml的培养基,可以浓缩到多少啊?
求指导!!!!
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发表于 2016-12-27 08:53:44 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2016-12-24 20:21
1、不会
2、不知道
3、看细胞分泌能力,我养DC,分泌很厉害

好的,谢谢
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发表于 2016-10-7 09:17:37 | 显示全部楼层
1、是用100kd的管子,买的时候,会给说明书的。我记得说明书建议是3000rpm*5min,但实际操作的时候可以自己调整,我一般是先用3000rpm转5min,拿出来看看浓缩了多少,然后再酌情考虑是否再离心一次。
2、我个人经验,10ml的培养基可以浓缩到1-2ml。但是,私下里认为,浓缩以后再用SBI试剂盒,杂质可能会更多。因为我用过浓缩和非浓缩的方法,感觉前者提取的“沉淀”明显增加了。

后来,我对SBI的protocol做了改良:先是1500rpm*30min,然后13000rpm*20min(这个转速是参考RIPA提取蛋白的,目的是进一步去除大分子和细胞碎片,选择13000rpm是因为,普通的离心机只能达到这个速度了),然后再过0.22um的滤器,进一步去除大颗粒。

然后再用100kd的管子浓缩,这样纯度会增加不少~
即使不用管子浓缩,这样的步骤也有利于增加纯度。

供参考~
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 楼主| 发表于 2016-10-7 09:41:14 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2016-10-7 09:17
1、是用100kd的管子,买的时候,会给说明书的。我记得说明书建议是3000rpm*5min,但实际操作的时候可以自己 ...

非常感谢,能有这样的交流,
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 楼主| 发表于 2016-10-7 10:53:27 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2016-10-7 09:17
1、是用100kd的管子,买的时候,会给说明书的。我记得说明书建议是3000rpm*5min,但实际操作的时候可以自己 ...

请问,你用SBI提取的exo打过电镜吗?是不是kit提取的很难出好看的图啊,
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 楼主| 发表于 2016-10-7 10:54:05 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2016-10-7 09:17
1、是用100kd的管子,买的时候,会给说明书的。我记得说明书建议是3000rpm*5min,但实际操作的时候可以自己 ...

请问,你用SBI提取的exo打过电镜吗?是不是kit提取的很难出好看的图啊。
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发表于 2016-10-7 19:16:42 | 显示全部楼层
medjinjuan 发表于 2016-10-7 10:54
请问,你用SBI提取的exo打过电镜吗?是不是kit提取的很难出好看的图啊。

打过,嗯,杂质比较多,做了几次,才勉强满意。到了审稿人手里,也argue了一番,反正最后通过了,哈哈
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发表于 2016-10-8 12:24:26 | 显示全部楼层
我用的15ml的100KD的超滤管是4000转大约是2000多g离心了20分钟离心到250μl左右,因为细胞房里的离心机比较小,要是用3000g离心时间可能可以缩短
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 楼主| 发表于 2016-10-13 13:30:02 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2016-10-7 09:17
1、是用100kd的管子,买的时候,会给说明书的。我记得说明书建议是3000rpm*5min,但实际操作的时候可以自己 ...

大神大神,我看你写的改良的方法是最后再用100KD的超滤管子浓缩,而不是最开始就用,是我理解有误解了吗?
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发表于 2016-10-13 18:28:18 | 显示全部楼层
medjinjuan 发表于 2016-10-13 13:30
大神大神,我看你写的改良的方法是最后再用100KD的超滤管子浓缩,而不是最开始就用,是我理解有误解了吗 ...

嗯,最后再用啊~前面你先用各种方法把能去掉的杂质都去掉,然后再浓缩,应该会使浓缩液不那么粘稠吧,个人感觉。。。如果一开始就浓缩,那么多杂质混在最后的浓缩液里,后面处理如果充分的话,应该也行~~
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 楼主| 发表于 2016-10-14 12:00:17 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2016-10-13 18:28
嗯,最后再用啊~前面你先用各种方法把能去掉的杂质都去掉,然后再浓缩,应该会使浓缩液不那么粘稠吧,个 ...

好的,谢谢大神啦·
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