麻烦大神们鉴定一下电镜图

pytruth

最近从试剂法提取转换到超离法提取外泌体，尝试了从血清和细胞上清里提取外泌体。2ml血清用PBS稀释至12ml、48ml 培液先浓缩成12ml超速离心分离得到的外泌体，重悬于100ul PBS中。

吸取样品20ul 滴加于铜网上沉淀10min，滤纸吸去浮液，吸去醋酸双氧铀10ul滴加于铜网上沉淀90s，滤纸吸去浮液，常温干燥数分钟，上机观察。都是一个个白球，不知道是不是？而且可能由于我提取完之后4度放了三天再做电镜，有点团聚。最近正在赶实验，麻烦各位大神看到了一定给鉴定一下，提提意见!十分感谢！

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pytruth

ashey 发表于 2016-10-31 09:41
超速离心的话不应该有经典的茶托样结构吗？坐等大神们来鉴定。

我也是这么觉得的，也许跟染色有关？

pytruth

hzangs 发表于 2016-10-31 10:49
这是我拍的，利用试剂盒沉淀的样品。 这张图是特地拍了一下 样品里的球状结构。这个可以肯定不是外泌体， ...

还想请教一下：1.第五张或者第六张图是细胞培液提取的，里面感觉有点茶托样结构，你觉得会是吗？
                     2.我没有用戊二醛什么的固定，直接负染，会不会跟染色有关系？
                     3.我是按照Thery.C文献的流程超离提取的，超离提取细胞培液和血清后里面也会有大量杂蛋白吗？

pytruth

hzangs 发表于 2016-10-31 12:41
给您图片的右下角打了号码。6号图的结构明显不是外泌体，可能是抱团的蛋白。7号图的结构明显直径过大。8 ...

谢谢版主！血清我是稀释后超离的，2ml稀释到了12ml，超离前还过了0.22um滤膜。版主的意思是我的图里照的是蛋白的可能性比较大？我的电镜图中间只能看到这样的一些类似蛋白的小点，看不到类似囊泡的结构，会不会是我提取中间有问题？我按照Thery文献当中说的是要在第一次100000g离心后直接倒掉离心管中上清液，第二次100000g离心之后也要倒干净离心管中的上清液再用100ulpbs冲洗，不知道这两步中倒出上清液会不会对exosome得率有影响？

pytruth

hzangs 发表于 2016-11-1 10:14
不要倒……  要吸……
要吸掉上清…… 倒的话 真的会倒掉很多沉淀的
还有  一般血清稀释10-20倍。 ...

好的，谢谢，超离完两次都要用枪吸吧？第二次超离完要吸的干净一点再加入pbs溶解？我第一次超离完好像还能看到点沉淀，第二次就看不到了，可以只超离一次吗？还想问一下，超离前用0.22um滤膜过滤会不会导致外泌体得率降低？

pytruth

hzangs 发表于 2016-11-1 17:51
第一次不要吸太干净。   你很可能把沉淀给扔掉了……  所以你第一次能看到沉淀，洗一次就看不到了  o(╯ ...

好的。请问用超滤管浓缩细胞培液再超离对外泌体得率有影响吗？我看有的文献超离转速更高，超离时间也长，超离的时间和转速提高一些会不会能提高外泌体得率？

pytruth

hzangs 发表于 2016-11-2 11:36
浓缩细胞培液后  细胞培液会变粘稠，反而不容易超离得到外泌体。 而提高转速和时间会不会提高得率，我没 ...

请问师兄有尝试过浓缩了细胞培液之后再超离吗？
是说45ml上清液直接离心要比浓缩后再超离得到的外泌体要更多？
我浓缩完了感觉细胞培液并没有很粘稠，用的是100kd的超滤管，不知道是不是管子用的有问题？

pytruth

hzangs 发表于 2016-11-4 16:18
100kd的没有尝试过。  你可以试试。  100KD的浓缩可能会好一些，我之前用10KD的浓缩过，浓缩后确实会很粘 ...

好的，谢谢！

pytruth

katekitekite 发表于 2016-11-8 16:33
版主  你浓缩后  用浓缩液稍微吹洗滤膜了么  感觉BCA测浓度差好多

没有，就是尽量吸干净了，因为我感觉100kd的管子浓缩完还比较稀，下回我也试试

pytruth

karen 发表于 2016-11-8 19:22
版主好厉害!

刚上手细胞外泌体这块，还是菜鸟，互相学习