有没有 简单好用又便宜的miRNA qPCR检测方法？

hzangs

没有？

这个可以有！！！而且hzangs对该方法进行了测试！引物的评判一般考虑特异性和扩增效率，特异性可以通过qPCR溶解曲线的峰型得出，而扩增效率需要比较不同方法、不同引物对同一基因的扩增效果才可得出。考虑到扩增效率评定比较繁琐，所以hzangs在测试时只考察了引物的特异性问题。hzangs利用该软件设计引物10对，以抽提的细胞total RNA作为起始RNA，利用该策略进行qPCR检测。其中7对在所有样品中溶解曲线均为单峰，2对在个别样品中出现杂峰，1对在所有样品中出现杂峰。另：出现杂峰的3对引物，其中2对引物的CT值在30以上，可以认为是极低丰度miRNA。
补充两点：1、 生成的引物在 运行算法  后 产生的新文档里！！！ 2、加尾后 RNA不需要纯化，直接吸取一定数量加尾反应液进行逆转录即可。
软件在此！  方法请见微信推文！  链接：https://mp.weixin.qq.com/s/JoJczBvNTG76GpXbygca8g
使用该方法发文章，记得引用原发明人的论文。
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释疑：
推出该方法后有朋友在微信后台留言认为这就是常规的加尾法检测miRNA，用软件设计加尾法miRNA引物本身就是个错误。  hzangs首先在这里感谢这位朋友的批评和意见。不过对于技术的探讨是仁者见仁智者见智的事情。
hzangs在此解释一下该方法与传统加尾法检测miRNA的技术差别：
传统的加尾法上游引物是miRNA序列本身，下游则是通用引物。通用引物的问题在于没有特异性，传统加尾法miRNA qPCR的引物特异性完全依靠上游引物，这就导致了传统的方法特异性低，qPCR过程容易出现非特异性扩增等问题。hzangs分享的方法下游引物的3‘端引入了靶miR的几个碱基，增强了特异性。同时基于引物设计软件自带的算法选择了下游引物3'端与靶miRNA匹配的碱基数。这也是为什么该方法需要引物设计软件的原因。如果大家还有什么问题，可以在本帖留言，与hzangs就该方法进行讨论。

hzangs

红桃k 发表于 2017-3-15 16:09
用了之后怎么闪退啊。。。。

看来没有好好读推文哦，好好研究一下推文    引物在运行算法之后产生的新文档里。

hzangs

一路前行2018 发表于 2017-3-16 08:55
非常棒的 推文！！！请问各位怎么获取纯的miRNA?

这个我查过了  需要买miRNA抽提kit    total RNA的话可以trizol

hzangs

一路前行2018 发表于 2017-3-16 11:28
应该是系统的问题，我刚开始用win10也不行，后来换了win7就OK了

好哒。  可能这个软件比较老， win10不兼容

hzangs

嘟嘟酱 发表于 2017-7-20 20:53
受我一拜

hzangs

mydjx 发表于 2017-11-23 10:55
日常膜拜大神

hzangs

Lillian 发表于 2018-4-24 13:06
请问下这个软件的引物设计是只适用这个方法，还是其他方法的也可以再这里设计 ...

仅用于该方法。

hzangs

pengqiao0605 发表于 2018-4-29 15:59
下载了这个软件，按照流程操作，运行的时候出现闪退，而且并没有新的文档生成，求指教 ...

可能系统不兼容。  右键属性，兼容模式打开试试

hzangs

acmdy1995 发表于 2018-11-21 17:13
为什么逆转录引物要自己设计而不用OLIGO DT呢

其实使用oligodT 也是可以的， 但是那样的话  qPCR的时候 下游引物也需要用oligodT  这样会降低反应的特异性。 文中介绍的方法其实是对传统加尾法的一个优化改良。使用一个特异性的逆转录引物引入人工设计的序列，提升下游引物的结合特异性从而 提升了加尾法做qPCR的特异性。

hzangs

tianyq 发表于 2021-3-15 12:33
您好，逆转录引物序列CAGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTVN这后面的VN是什么...

简并序列。  你不用管它， 直接给引物公司合成就好， 他们知道。