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外泌体处理细胞

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发表于 2015-4-15 17:47:42 | 显示全部楼层 |阅读模式
有没有做外泌体处理细胞的?一般设置什么样的浓度梯度啊?
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发表于 2015-7-8 10:54:36 | 显示全部楼层
梦想照进现实 发表于 2015-7-8 10:17
是否有文献支持~求文献细读,谢谢!

这篇Nature immunology <Exosomes mediate the cell-to-cell transmission of IFN-a-induced antiviral activity>,exo干预细胞基本都是用的5ug/ml;
这篇circulation <Circulating Exosomes Induced by Cardiac Pressure Overload Contain Functional Angiotensin II Type 1 Receptors>用的是exo粒子数定量。
这篇JACC <Plasma Exosomes Protect the Myocardium From Ischemia-Reperfusion Injury>同时用了粒子数和蛋白质量。

其实任何一篇关于exo的文章,你仔细去找找,大都能找到一些剂量。
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发表于 2015-7-21 08:49:04 | 显示全部楼层
本帖最后由 惜名 于 2015-7-21 08:54 编辑
kadak007 发表于 2015-7-20 20:56
版主,请指导下,PBS-exo处理细胞,你一般让它们共同孵育多久呢?按小时算,还是按天算? ...

这个恐怕得看你的exo通过什么途径发挥作用、以及你要检测什么。
--------------
如果你推测exo可以通过膜表面蛋白作用,那么时间应该是很快的,只要exo和细胞接触就可以作用了。然后你如果要检测mRNA表达,数小时就可以了。如果做蛋白,那就得16-24小时。
----------------
如果你推测exo是通过里面的miRNA作用,那么时间就得参照转染miRNA的了,例如,我看到的文献一般是在转染miRNA 36小时做检测。因为miRNA进到细胞还需要如靶序列结合、然后作用。
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发表于 2015-4-19 10:46:07 | 显示全部楼层
ffp1988 发表于 2015-4-18 10:09
您所说的10ug/ml是指??   外泌体的浓度?  怎么测出来的?

10ug/ml是指,每ml培养上清中加入10ug以蛋白衡量的外泌体。
这牵扯到一个外泌体浓度计算的问题,目前认为外泌体无法用Nano或电镜测浓度(或粒子数),文献多用蛋白量来间接反应外泌体浓度。
譬如,你有100ul PBS-exo,经裂解后测蛋白浓度,计算出这100ul PBS-exo共含有20ug蛋白(假设)。那么,这100ul PBS-exo加到六孔板中的1个孔(2ml培养基)中,即得到10ug/ml的外泌体干预浓度了。
-------------------
这里还有一个问题,10ug/ml的浓度只是相对你的实验体系而言的,因为目前认为不同的提取方法会导致exo纯度不一。例如有人认为kit提取的exo含有杂蛋白,这无疑会增加裂解后测得的蛋白浓度,因此使得不同提取方法之间的“外泌体浓度”没有可比性。
梯度密度离心法得到的exo或许目前认为是最纯的。
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发表于 2015-7-2 10:02:24 | 显示全部楼层
kadak007 发表于 2015-7-2 00:43
非常感谢版主,完全取代了我老板的地位...... 我打算拿大鼠肌细胞试下
你做的实验 每个孔里exo加 ...

我用SBI提取的exo,得率之高令人乍舌。。。
所以我给出的浓度可能不是很准确,混杂了一些细胞培养液中的蛋白,供你参考吧。
大约每孔加50ul PBS-exo悬液,每ul约0.2ug。
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发表于 2015-6-25 23:38:02 | 显示全部楼层
丁倩倩 发表于 2015-6-25 16:28
我做的一般都是裂解后的浓度偏低

惜名在5楼回复时写到:“譬如,你有100ul PBS-exo,经裂解后测蛋白浓度,计算出这100ul PBS-exo共含有20ug蛋白(假设)。那么,这100ul PBS-exo加到六孔板中的1个孔(2ml培养基)中,即得到10ug/ml的外泌体干预浓度了。”
仔细读完后,感觉他还是分两步走的,同时提2批等量的exo,1批裂解后测浓度;明确浓度后,另一批处理细胞。
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发表于 2015-4-16 20:57:59 | 显示全部楼层
我之前看的一篇文献10-50ug/mll都是可以的,200ug/ml以上会有脂毒性(我老板对这种说法一直嗤之以鼻,认为是提取试剂盒中携带的试剂毒性),我之前做过浓度梯度,现在一般都用10ug/ml
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发表于 2015-4-16 11:08:19 | 显示全部楼层
用外泌体干预细胞没有可参考的依据。你可以自己做个浓度梯度,在我看的有限的文献里,似乎都没有提外泌体浓度。
我个人经验,4ml上清提取的外泌体(DC来源),用200-400ul PBS重悬,然后用100ul干预一个孔(6孔板,HUVEC),是可以得到阳性结果的。
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发表于 2015-4-18 10:09:05 | 显示全部楼层
丁倩倩 发表于 2015-4-16 20:57
我之前看的一篇文献10-50ug/mll都是可以的,200ug/ml以上会有脂毒性(我老板对这种说法一直嗤之以鼻,认为 ...

您所说的10ug/ml是指??   外泌体的浓度?  怎么测出来的?
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发表于 2015-4-19 12:12:45 | 显示全部楼层
您讲的非常详细,我在想如果exo被蛋白裂解液裂解后在取处理别的细胞,还能不能被摄取?
还是把提取的exo平分成两组,一组测浓度,一组做实验????
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发表于 2015-4-19 21:43:17 | 显示全部楼层
惜名师哥已经说得很详细了,你做干预的话不用裂解,直接用提取的exosome用BCA(或其他方法)测浓度就好,建议也是先做个浓度梯度
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发表于 2015-4-19 22:59:27 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2015-4-19 10:46
10ug/ml是指,每ml培养上清中加入10ug以蛋白衡量的外泌体。
这牵扯到一个外泌体浓度计算的问题,目前认为 ...

非常详细,谢谢....
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 楼主| 发表于 2015-4-20 13:11:24 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2015-4-16 11:08
用外泌体干预细胞没有可参考的依据。你可以自己做个浓度梯度,在我看的有限的文献里,似乎都没有提外泌体浓 ...

多谢惜名!!我用的间充质干细胞外体,180ML上清重悬到1.2ml的PBS中,加到种有肿瘤细胞的96孔板里,做了四个梯度(以外体的体积为变量的),测的MTT结过飘忽不定,不知道是MTT实验本身的问题还是什么呢 好纠结!
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发表于 2015-4-24 23:48:05 | 显示全部楼层
好贴,顶一下
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