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楼主: 向荣y

外泌体处理细胞

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发表于 2015-7-2 00:43:20 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2015-7-1 08:26
我做HUVEC(人脐静脉内皮细胞)的炎症反应,目测细胞密度50-95%的范围内都可以。
25cm2的瓶子面积为六孔 ...

非常感谢版主,完全取代了我老板的地位...... 我打算拿大鼠肌细胞试下
你做的实验 每个孔里exo加多少微克起步呢?有没有一个比较大众化的浓度梯度?
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发表于 2015-7-2 10:02:24 | 显示全部楼层
kadak007 发表于 2015-7-2 00:43
非常感谢版主,完全取代了我老板的地位...... 我打算拿大鼠肌细胞试下
你做的实验 每个孔里exo加 ...

我用SBI提取的exo,得率之高令人乍舌。。。
所以我给出的浓度可能不是很准确,混杂了一些细胞培养液中的蛋白,供你参考吧。
大约每孔加50ul PBS-exo悬液,每ul约0.2ug。
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发表于 2015-7-3 16:23:16 | 显示全部楼层
惜名版主,用exo处理细胞,你有没有想过用小鼠源的细胞?毕竟后续功能实验时都得用小鼠的;
还是说,如果exo是人源的,那么处理的细胞也必须是人源的,功能实验时,不可能拿人做,只好用小鼠。
有没有纠结过这个问题?
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发表于 2015-7-3 16:40:37 | 显示全部楼层
kadak007 发表于 2015-7-3 16:23
惜名版主,用exo处理细胞,你有没有想过用小鼠源的细胞?毕竟后续功能实验时都得用小鼠的;
还是说,如果ex ...

有纠结过啊。。。
但是现实条件所限啊,人源的HUVEC是最常见、也是比较容易获得的。

如果做miRNA,其实人源和小鼠源序列几乎都是一样的
如果做蛋白,或许有点顾虑。
不过anyway,这是没办法的折中了。毕竟不求大paper,只求毕业。。。

P.S. 你要点回复我,我才能看到消息,否则我收不到你的提问。。。
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发表于 2015-7-4 11:17:27 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2015-7-3 16:40
有纠结过啊。。。
但是现实条件所限啊,人源的HUVEC是最常见、也是比较容易获得的。

呵呵,好的,感谢版主~
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发表于 2015-7-8 10:17:35 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2015-4-19 10:46
10ug/ml是指,每ml培养上清中加入10ug以蛋白衡量的外泌体。
这牵扯到一个外泌体浓度计算的问题,目前认为 ...

是否有文献支持~求文献细读,谢谢!
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发表于 2015-7-8 10:54:36 | 显示全部楼层
梦想照进现实 发表于 2015-7-8 10:17
是否有文献支持~求文献细读,谢谢!

这篇Nature immunology <Exosomes mediate the cell-to-cell transmission of IFN-a-induced antiviral activity>,exo干预细胞基本都是用的5ug/ml;
这篇circulation <Circulating Exosomes Induced by Cardiac Pressure Overload Contain Functional Angiotensin II Type 1 Receptors>用的是exo粒子数定量。
这篇JACC <Plasma Exosomes Protect the Myocardium From Ischemia-Reperfusion Injury>同时用了粒子数和蛋白质量。

其实任何一篇关于exo的文章,你仔细去找找,大都能找到一些剂量。
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发表于 2015-7-8 11:02:32 | 显示全部楼层
谢谢!拜读
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发表于 2015-7-20 20:56:24 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2015-7-2 10:02
我用SBI提取的exo,得率之高令人乍舌。。。
所以我给出的浓度可能不是很准确,混杂了一些细胞培养液中的 ...

版主,请指导下,PBS-exo处理细胞,你一般让它们共同孵育多久呢?按小时算,还是按天算?
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发表于 2015-7-21 08:49:04 | 显示全部楼层
本帖最后由 惜名 于 2015-7-21 08:54 编辑
kadak007 发表于 2015-7-20 20:56
版主,请指导下,PBS-exo处理细胞,你一般让它们共同孵育多久呢?按小时算,还是按天算? ...

这个恐怕得看你的exo通过什么途径发挥作用、以及你要检测什么。
--------------
如果你推测exo可以通过膜表面蛋白作用,那么时间应该是很快的,只要exo和细胞接触就可以作用了。然后你如果要检测mRNA表达,数小时就可以了。如果做蛋白,那就得16-24小时。
----------------
如果你推测exo是通过里面的miRNA作用,那么时间就得参照转染miRNA的了,例如,我看到的文献一般是在转染miRNA 36小时做检测。因为miRNA进到细胞还需要如靶序列结合、然后作用。
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