外泌体研究小组第二次会议总结

惜名

2015年4月18日，周六，上海的下午不冷也不热，正是小聚好时节。来自中科院上海生命科学院、复旦医学院、上交医学院、上海二军大、上海大学、浙大医学院等6所院校（排名不分先后）的16名外泌体研究者，在生科院高大上的会议室里举行了“外泌体研究小组第二次聚会”。

本次聚会有6人（Johnny、倩倩、惜名、宝莲、Alice、游虾）进行了PPT交流。会议基本上可以分为两个阶段，第一阶段是以PPT演讲为中心的交流，第二阶段是自由讨论。

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PPT内容有部分重叠，不再一一赘述，下面分享几个重点讨论的问题。

1、外泌体提取哪家强？

毫无疑问，山东蓝翔排第一。

排第二的或许应该还是超离吧，这是经典大paper久经实践的好方法。至于得率，Johnny用Nano对比了超离和SBI提取后exo的总粒子数，竟然发现二者在一个数量级。这似乎是说SBI的提取效率和超离差不多？当然，也有人认为，Nano检测粒子数不能准确反应exo含量，误差太大。

应该说，不少高分文献也在用SBI，因此这个kit可靠性还是比较高的。笔者使用过101bio和SBI，个人经验是二者提取后进行下游干预实验都能得到阳性结果，未对比二者的提取效率差异。

倩倩用101bio提取exo后做了质谱分析，发现含量最高的蛋白竟然是BSA（培养基中含有的一种成分），如果倩倩的操作没问题、质谱分析也可靠的话，这无疑说明101bio提取的exo含有杂蛋白。SBI这方面的试验我们小组没人做过。当然，值得一提是的，倩倩的质谱分析竟然连exo的已知marker都没检测出来，这个质谱分析或许需要重复。

Life的使用者应翔因故未参加此次聚会。

最后总结，有人强烈认为kit提取exo杂质较多，倩倩的质谱分析或许也提供了即使是不太可靠的证据。笔者认为，kit提取exo即使含有一定量杂质，只要你的实验设计能够容忍这些杂志，或许也是能接受的，毕竟，kit更加简单，而且也经过了高分文献的验证。当然，如果条件允许，用超离更加好。

2、外泌体电镜下形态是否有标准？

经典文献的exo电镜图片以“杯托样”结构为主，也可以形象的看成“嘴唇样”、“咖啡豆样”，其鲜明的特征是有“褶皱”。Johnny用超离提取exo，电镜图片与经典文献吻合度很高。而其余人员（包括复旦、上交、浙大）基本都是用kit提取的exo，电镜下显示为一个空泡样结构，形状基本是正圆形，没有褶皱。文献认为，这种形态上的区别和提取方法有关系。超速离心会使得exo被强烈挤压，因此产生褶皱。Kit提取则没有这个现象。

3、电镜下外泌体亚结构和直径是否很重要？

经典文献的exo电镜图有时可以看到一些“亚结构”，“杯托样”exo的内部还有一些密度不均匀、明暗相间的小区域，但此次小组人员用kit提取的则没有看到这些结构。沛渊认为，这或许和电镜拍摄时电压强度有关系，电压越大，投射性越好，越可以看清楚内部结构。沛渊介绍，生科院电镜室老师建议120kv的电压。另外，这或许也和染色过程有关系，目前exo染色以磷戊酸或铀负染为主，操作还是比较简单的。Johnny介绍了一种更加复杂的染色方法，但是效果不佳。

关于直径，kit提取的exo似乎直径偏小，较大者70nm，大多数的均在20nm上下，有人还看到了更大的，直径在400-500nm。Johnny用超离提取exo，Nano结果提示粒子直径峰值在100nm，结果与文献较为符合。

关于直径，目前一般认为30-100nm的称为exo，更大的则属于MV了。游虾经过仔细查阅文献，发现30-100nm的直径有深层次原因。Exo是脂质双层结构，其分泌依赖细胞内器，脂质双层结构决定了exo不能太小，否则便无法成为一个囊状结构了，分泌过程依赖细胞内器决定其也不能太大，不能大于其来源的母体。

4、蛋白Marker跑不出来怎么办？

目前已知的exo marker达十余种之多，有些marker并非每种细胞来源的exo都会表达，因此当marker跑不出来时，可以考虑换其他marker试试。本次聚会认为，跑出来2-3个marker就OK了。譬如，本次聚会很多人都跑不出CD9，CD63和Alix似乎比较好跑，也有人推荐试试TSG101。沛渊强调，exo marker甚至有某种程度的种属特异性，因此跑marker时大家应该尽量参考你的细胞来源的exo在文献中被证实存在哪些marker，不要盲目尝试。

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第二阶段，自由讨论环节，该过程大约1.5小时。

每个人就个人经验和兴趣与他人进行了针对性探讨。这部分内容比较杂乱，有些人会讨论很基础、很技术的细节，有些人会讨论整个实验思路，因此也就没办法记录了。

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感谢Johnny安排了本次活动，借用的生科院的会议室非常专业。Johnny自费为大家购买了一些小零食，还给与会者泡了他们家乡今年的新茶，我怎么喝都比西湖龙井更加袭人。感谢提供PPT进行交流的童鞋，也感谢所有参与人员的经验分享。

本次聚会讨论的还是以基础方法为主，因为大家进展都比较缓慢。我们暂定法桐叶变黄的时节再次小聚，期待届时能有更多童鞋参加，也祝愿在这半年里大家能做出更多的结果。

P.S. 本小结帖凭记忆所写，如有谬误，请各位及时指出，我第一时间更改。