关于细胞培养上清中提取外泌体的相关问题

lczyld

我培养的是细胞系，准备从培养上清中提取外泌体，有做过相关实验的前辈么。1、大概至少得多少上清，才能理想地提取外泌体？
2、换用无外泌体血清的时机和培养时间
3、用的是培养皿还是培养板
如有相关经验的，希望能给予指导，一起交流交流，十分感谢！

baishixiaoyaozi

这个很难给你确切答案，不同的细胞系分泌exosome的能力不一样，对血清饥饿的耐受不一样。你可以上pubmed或google scholar找一找，是否有人用过一样的细胞系，他们的实验步骤是怎么样的。比如我之前养原代细胞，用T150培养瓶，每次做实验需要8-10个T150 flask （80% confluency），用无血清培养基（没钱买exo-free FBS），培养24小时，收集上清（~120毫升），差数离心后再超离。200微升重悬exosome，终浓度大约10^8/mL。

lczyld

baishixiaoyaozi 发表于 2017-8-1 23:36
这个很难给你确切答案，不同的细胞系分泌exosome的能力不一样，对血清饥饿的耐受不一样。你可以上pubmed或g ...

谢谢前辈的热心回答！请问您的120ml上清直接拿去超离么，看到文献里有浓缩这一步，不知道怎么做到的。因为我买了ExoQuick-TC Exosome Precipitation Solution (System Biosciences)，推荐是5毫升上清加1毫升试剂，所以上清不能太多了，试剂盒总共就5毫升。

lczyld

tshenbin 发表于 2017-8-2 21:57
建议你用Amicon Ultra-15 100K NMWL进行超滤浓缩，这样可以减少上清体积。

好的，十分感谢您的建议！我试试

lczyld

tshenbin 发表于 2017-8-2 21:57
建议你用Amicon Ultra-15 100K NMWL进行超滤浓缩，这样可以减少上清体积。

前辈，离心时间和离心力多少最合适？

jinzc0228

baishixiaoyaozi 发表于 2017-8-1 23:36
这个很难给你确切答案，不同的细胞系分泌exosome的能力不一样，对血清饥饿的耐受不一样。你可以上pubmed或g ...

请问您是120ML上清总共得到200微升的外泌体，还是每个超离管底部最后的沉淀用200微升重悬

qyjinghui

baishixiaoyaozi 发表于 2017-8-1 23:36
这个很难给你确切答案，不同的细胞系分泌exosome的能力不一样，对血清饥饿的耐受不一样。你可以上pubmed或g ...

老师您好，想跟您咨询一个问题。我们打算用药物处理脐带间充质干细胞，然后对比处理后和处理前外泌体内容物miRNA的差异。我们对P3代的细胞进行处理，在70％汇合度的时候加药处理2天，这时候细胞已经长满了，先不传代，我再用不含血清的培养基继续进行饥饿培养，48h后收集上清进行超离。还是加药处理2天等细胞长满了，传代之后再用不含血清的培养基饥饿培养，在收集上清进行超离呢？谢谢您的回答。

baishixiaoyaozi

qyjinghui 发表于 2017-8-22 13:44
老师您好，想跟您咨询一个问题。我们打算用药物处理脐带间充质干细胞，然后对比处理后和处理前外泌体内容 ...

我的建议是药物处理之后马上换无血清培养基收集细胞外泌体，因为传代之后细胞状态会发生变化，此时收集的外泌体中miRNA种类和数量若发生变化，原因可能会同时来自药物处理以及传代导致的细胞状态变化。
祝实验顺利！

不用叫我老师，对于外泌体，我还是个新手。

wzttray

楼主问一下，你用浓缩之后提取效果怎么样？