Tranwell小室在外泌体功能研究中的初步应用

落叶知秋

在此，首先感谢Jonny为我们精心筹办的线下第二次聚会，希望外泌体之家论坛在诸位的共同努力下蓬勃发展，同时也期待大家能在这个论坛里多多交流，经验也好，疑惑也好，交流可以解惑，也可以碰撞出思维的火花。

为响应版主Jonny和惜名的号召，我也在咱们论坛里浅谈一下接触外泌体以来的一些想法和感受，主要是miRNA测序和利用transwell研外泌体功能，其中不乏有失严谨或者错误之处，请各位同胞多多批评和指正。

其实，现在大家（主要是对外泌体有所接触的人）对外泌体的态度不一，有些人对它Vehicles of IntercellularSignaling, Biomarkers and Vectors of Cell Therapy等等作用深信不已，觉得外泌体研究可以成就疾病诊断与治疗的重大突破，甚至是攻克。也有些人持有怀疑的态度，怀疑这种纳米级别的东西果真能调节肿瘤的转移？又如何延缓各种慢性疾病的进展？抑或是干细胞干性的维持等等。个人觉得“干一行，爱一行”，高分的paper来源于坚定的信念，以及不懈的努力付出。

    一、外泌体microRNA的测序

其实说到测序，往事不堪回首，前前后后花了两个多月时候才收集完样本（我做的是细胞上清），或许因为正常细胞的上清，也或许是那段时间血清问题，细胞状态一直不好，所以要想完成750ml上清收集，真心不是件容易的事。

无论是文献报道还是前期nanosight结果对比,用含10%FBS培养基培养细胞后收集上清中的外泌体，其来源于血清的含量绝对不会比细胞来源的少。这其实就是目前比较困扰的很多研究人员的一个问题，如果是肿瘤细胞还好，不加FBS熬个两天细胞状态还行，但是对于有些“娇贵”的细胞恐怕就不尽人意了。Exosome-depleted 完全培养基，这个对绝大多数同学们来说不太现实，100,000 xg 过夜（16h，不过在交流会上复旦的达人用8h），更何况离的不是纯FBS，而是用培养基稀释成20%FBS的2X完全培养基，刚开始我也干过这事，200,000 xg ，2h（每次只能离心20ml），后来冷静想想，果断放弃这条路，改走“基础培养基”道路。多亏我细胞生命力旺盛，无血清培养基培养两天后细胞状态基本没有特别大的变化（FBS-free是否影响细胞的状态，影响外泌体的分泌及其内容物，暂时未有人专门研究过）。当然现在也有专门用于外泌体研究的培养基，惜名在外泌体之家有写过相关的帖子[http://www.exosome.com.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=106]感兴趣的可以了解下。

（一）、测序的过程

细胞设处理组和对照组，培养，传代，完全培养基培养48h，弃上清换液，改用FBS-free基础培养基，48h后收集上清。当然具体采用无血清培养的时间段及无血清培养时间，就看你细胞的状态了，时间越短，对细胞影响越小，相反，分泌的外泌体量也会受到影响。现在测序的公司有很多，包括一般的测序公司（例如华大等）和一些专门致力于外泌体测序的公司，例如锐博和裂冰等。这两家公司我们实验室都有做过。我选择锐博，主要是看重他们有外泌体抽提的服务，1500元/样（不管你给多少上清，直到外泌体中RNA质检合格为止），这个比较省事。另外miRNA测序收费5000多/样本，测序价格每个公司相差不是特别大，测序周期说是1个半月（但后来算算两个半月左右）。

刚开始送了200ml（100ml/样本）上清，一个礼拜后给我回信质检不合格（外泌体抽提的RNA量不够，0.5ug方能质检合格），为此，我开始大量培养细胞及收集上清，最后又送了500ml上清，这次质检合格。

左盼右盼总算是把最后的结果给盼回来了，初一看，结果不是特别让人满意，相比实验室师姐在裂冰公司做的测序结果，我的结果数据量有点少的可怜，表达差异有统计学意义的只有9个miRNA，但后来仔细分析了一下，之前研究的几个比较关键的miRNA都在其中。这点还是晒为安抚了我受伤的心灵。锐博还有一点比较好，就是送10个miRNA的通路预测，不过这就仁者见仁智者见智了。

（二）、测序的注意事项

1、一定要注意是用去exosome的培养基或者商品化血清（上文已提及）或者直接用无血清培养基，这个依据细胞状态来选择。

2、不同的细胞分泌的外泌体量不同及外泌体来源地的RNA量也有较大不同，这就造成送样量千差万别，本人的送样量仅是一个特例。

二、Tanswell 小室对外泌体功能的研究

Transwell小室在细胞功能学研究中的重要作用相信大家都再熟悉不过，其膜的孔径不同作用也不同，主要用于共培养，侵袭，迁移等功能学实验。那么它如何在外泌体的研究中扮演重要角色呢？

外泌体50-120nm 的直径使得它能很轻易穿过孔径为0.4um 的Transwell小室，而细胞则基本不能透过0.4um的孔径，这样就使得该孔径的小室成为研究“细胞间通过外泌体的分泌来影响彼此的生物学功能”的工具。绝大部分人是将外泌体直接加入细胞上清中，然后研究其生物学特性，当然这一过程没有任何问题，这也更加直观的表明在这个过程中，外泌体起了主要作用。那么为什么还需要用到外泌体呢？个人觉得利用transwell能说明，细胞A可以通过主动分泌外泌体来影响B细胞的生物学功能，这更加符合生理学特征。当然这个过程也会给我们带来许多麻烦，所以，打算用Transwell做的小伙伴请三思而后行。

（一）基本实验过程（以研究A细胞在X因素处理下分泌的外泌体对B细胞移能力的影响为例）

X因素处理A细胞，同时设置对照组，将其接种于6孔板中，贴壁完全后安放Transwell小室（膜孔径大小为0.4um，膜的面积为4.67cm2 ，通俗点说就是放在孔板中的小室），如果未完全贴壁就安放小室，则六孔板中的细胞A会因为张力作用全部跑到板周边区域（只是个人一点经验而已），在小室中接种细胞B，具体的操作方法参考附件一。

以上诉方法进行共培养，待小室中细胞密度达90%左右收集小室细胞，做凋亡或者做侵袭迁移等实验。下图为预实验结果，X因素处理A细胞后与B细胞共培养，检测B细胞的迁移能力（同样用transwell小室完成迁移实验）。

图1. B细胞与X因素处理过的A细胞共培养，迁移能力显著降低。（技术问题导致图片添加后不清楚）

注意事项：

1、该实验绝对不能说明因素X处理的细胞A，通过外泌体来改变细胞B的生物学功能。而只能说明细胞B分泌的某种物质起了该作用，外泌体是其中的一种可能。

2、在共培养过程中，处理组和对照组的所有处理环节必须完全一致，因素X的处理必须在共培养前（A细胞接种于六孔板之前）完成。

3、Transwell小室膜的面积尽量买大一点的，也就是说最好是安放在6孔板当中甚至是更大膜面积的小室，这样才能保证有足够量的共培养后的细胞B做进一步功能学研究，具体的选择可以参考附件二。至于买什么牌子的Transwell看个人喜好。

4、研究细胞A分泌的某种物质对细胞B的影响，则将细胞A接种在下室（例如6孔板中）而将细胞B接种在上室（Transwell小室）。

5、接下来要证明上述共培养过程中是否是A细胞分泌的exosome在调节B细胞的功能过程中起了作用，我需要进一步完善实验，主要分为三部分，其一是研究A细胞分泌的外泌体是否可以主动进入细胞B，其二是研究在共培养过程中阻断A细胞外泌体的分泌或者B细胞外泌体的摄取是否能够阻断A细胞分泌某种物质降低B细胞迁移能力这一过程。最后就是分别抽提X因素处理的A细胞和对照组细胞的外泌体，直接加入到B细胞供，共孵育后检测其迁移等功能的改变（也就是平时大家用到较多的方法）。

落叶知秋

惜名 发表于 2015-5-19 10:05
几个问题请教一下楼主：
1、假设6孔板中的A细胞为悬浮生长，那么就不需要等待贴壁过程喽？可以在A细胞悬液 ...

谢谢版主的问题。
1、悬浮细胞不存在贴壁过程，固可在下室接种后直接放入小室。
2、迁移和侵袭实验用的孔大小有别于做共培养时候小室的孔径，至于共培养后上室细胞收蛋白还是rna或者再拿这些细胞做迁移侵袭实验都一样，都不用铺胶，只要选择合适孔直径，防止细胞穿过就可以了。
3.对于六孔板，下室2ml全培养基，上室1.5ml培养基。
4.这个不太好办，如果做共培养也可以试试。或者直接把下室培养基也更换成和较贵细胞一样的培养基试试看。
    因为有些问题我也没遇到过，所以上述观点仅作参考。

落叶知秋

这几天我又做了侵袭实验，那我就一道写写吧！
它与迁移实验不同的是需要铺基质胶。在这个过程中如何处理好铺胶过程是一个难点。我用的是BD的基质胶，按照说明书用无血清培养基稀释成冻存液（我自己取的名字），于-20℃冻存，此时的他是处于凝固状态的。具体的铺胶过程我就不多介绍，附件当中都有写到。在这里说几点细节：
1、BD的基质胶在铺胶前几个小时置于4℃解冻，不能置于室温，因为室温下，冻存液会很快凝固。
2、使用过程中我们会将冻存液配成工作液，也就是需要稀释后才能铺胶。随着基质胶浓度的改变，其阻止细胞穿透的能力越强。在这里比较关键的问题是，这个基质胶需要在合适的稀释比例下才能保证凝固和适度的阻止细胞穿透能力（比较拗口）。当以无血清培养基将冻存液稀释3倍时，稀释后的基质胶在室温下很块就凝固，而当10稀释倍时后置于37℃过夜也不会凝固。我做的是肿瘤细胞，将基质胶冻存液稀释6倍后（稀释的过程建议在冰上操作，因为在室温下，冻存液在枪头吸取的过程中就有可能凝固，就是这么夸张），取100ul稀释液铺胶于transwell小室中，37℃培养箱过夜后凝固，于小室中(在基质胶上)接种适量细胞（此时的细胞需要用无血清培养基重悬细胞），在小室下面加500ul含20%FBS的完全培养基，培养适宜时间后染色观察。
3、做transwell实验，虽然一个孔需要30多人民币（康宁的），但还是建议做下预实验，会节省很多时间，一般来说基质胶冻存液稀释倍数为5-8倍，如果你的稀释倍数可以在37℃隔夜凝固，那么就说明稀释倍数适宜。接下来就要考虑接种细胞的浓度，强烈建议接种前进行细胞计数，附件中有说到具体接种浓度，浓度高低决定差异的大小以及实验灵敏度。最后再是看侵袭的时间了。总而言之，漂亮的结果来自于实验条件的反复法摸索，经验教训的及时总结以及硬件设备的齐全（显微镜很重要）。
4、昂贵的小室是可以重复利用的
结晶紫染色拍照后，用冰乙酸洗脱结晶紫（可以测OD值，间接反映染色细胞数目，这张图也是可以放在文章中的），用PBS漂洗几次后晾干，24孔板中滴加胰酶，将小室置于其中，让胰酶消化小室膜下面细胞，时间可以长一点问题不大，PBS漂洗若干次后置于75%酒精过夜。最后就是取出小室在紫外线下“晒干”和“晒干净”。虽然有人反映，这样倒腾一下，空会变大，但是我在镜下看了许久，没有发现空有变大，而且实验过程中也没出现污染等问题。当然，如果属于有钱人的孩子呢，不建议重复利用啊！
以上都是一家之言，初来乍到，接触外泌体更是没多长时间，如表述有失严谨或者错误之处，请诸位批评指教，谢谢！

惜名

干货！怒抢板凳！落叶的exo-miRNA测序和transwell经验都非常赞，后面的童鞋要做可以少走一些弯路啦~

Damon

绝对好东西，好好研究

itooth

加油

seallin

lz的讲解十分详细，给我们外行的人很直观的帮助。唯一的不足，就是细胞培养液用的是无血清的FBS，这样不能反映真实状态，这只是饥饿状态下的细胞状态的分泌情形。其实细胞的分泌在有无血清条件下差别还是很大的，Eichelbaum在2012年的Nat. Bio...上提过这一点，它比较了有无血清细胞的分泌状态的差别是很大的，譬如分泌蛋白组就差别巨大。不过并没有比较exosome是否差别巨大。我一直觉得分泌蛋白和exosome是共同促进细胞间相互交流的，如果能同时分析这两个一定意义非凡。

惜名

几个问题请教一下楼主：
1、假设6孔板中的A细胞为悬浮生长，那么就不需要等待贴壁过程喽？可以在A细胞悬液加入6孔板中后立即放入小室了？
2、假设小室中的B细胞不做迁移、侵袭等，只提取蛋白或mRNA检测一些表达，那么还需要铺胶预处理小室么？在这种情况下，怎样、何时将B细胞悬液加入小室呢？
3、以6孔板为例，下孔加多少培养基？上面的小室加多少培养基呢？
4、如果细胞A和细胞B的培养基不一样，而且相差很大（譬如，小室中的B细胞非常娇贵，无法耐受A培养基），怎么办呢？

落叶知秋

seallin 发表于 2015-5-19 09:46
lz的讲解十分详细，给我们外行的人很直观的帮助。唯一的不足，就是细胞培养液用的是无血清的FBS，这样不能 ...

是的，您说的是完全正确的，使用去外泌体血清的培养基也是应了那句：巧妇难为无米之炊！要获得“去外泌体血清“的方式就是2X完全培养基超速离心过夜，这个对于很多实验室来说是incredible，尤其准备测序样本上，上清需要量比较大，为此不得已才选择无血清培养行饥饿培养。希望大家能提供更加好的方法解决这个问题！

yy8651

狂赞，好东西