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再次分享Transwell小室在exo研究中的应用

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发表于 2015-6-16 12:03:32 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 惜名 于 2015-6-16 12:05 编辑

落叶知秋在本板块分享了Transwell小室的应用,http://www.exosome.com.cn/forum. ... =214&extra=page%3D1
本人在此基础上进行了预实验,得到了较好结果,现分享如下

目的:查看A细胞是否通过分泌exo导致HUVEC(内皮细胞)高表达黏附因子(VCAM-1、ICAM-1等)
背景:A细胞为一种免疫细胞,其可以分泌促炎因子(TNF-α等)导致HUVEC高表达VCAM,但是否也可以分泌exo完成这一作用尚不清楚。
设计:6孔板正常培养HUVEC(贴壁细胞),达到一定密度后,于孔中放入Transwell小室,在小室中培养A细胞(悬浮生长),A细胞培养基加/不加GW4869。共培养8小时后,弃小室中A细胞,收6孔板中HUVEC,提mRNA检测VCAM-1和ICAM-1。
结果:1、和对照相比,A细胞共培养可以导致HUVEC分泌VCAM显著升高;2、加入GW4869后,A细胞共培养导致的VCAM升高较不加GW4869下降,但仍然高于对照组(好绕)。
结论:A细胞可以通过分泌“某些东西”导致HUVEC高表达黏附因子,这个“某些东西”包括exosome。


意义:该步实验能够证明A细胞的确可以通过exo参与HUVEC活动(共培养的方式),然后接下来提取A细胞分泌的exo直接加入培养基干预HUVEC得到一致的结果,然后做通路。整条思路就相对完整了。
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 楼主| 发表于 2015-6-16 16:23:45 | 显示全部楼层
第二种方法存在明显缺陷啊,该方法只能说明:A细胞分泌了“某些东西”至培养基中,“这些东西”可以导致B出现功能变化,但这和exosome有啥关系呢?
所以我觉得如果用第二种方法,也需要加一个GW4869,减少exosome分泌,如果能观察到“加GW4869组”和“不加GW4869组”B细胞的功能差异,则可以认为exosome
参与了这个作用。其实这样一来,和Transwell共培养很接近了。

P.S. 窃以为,大文章做到 GW4869是不能满足的,还需要给CD63加荧光信号,确认GW4869可以减少exosome分泌、并且B细胞摄取的荧光信号减少,才能真的证实exosome的确参与了A与B的功能作用。
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发表于 2015-6-16 15:35:35 | 显示全部楼层
你好,首先感谢你的经验分享。我现在也想探索A细胞对B细胞的功能影响。我在阅读文献中发现两种研究方法:第一种就是你说的通过transwell间接共培养的方式来研究A对B的影响;第二种:收集A细胞的培养基,用其处理B细胞,然后研究B细胞的功能。请问你认为这两种方法有何优缺点啊?或者应该如何选择合适的研究方法呢?水平有限,所以问题问的有点大,请见谅。
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发表于 2015-6-17 10:11:37 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2015-6-16 16:23
第二种方法存在明显缺陷啊,该方法只能说明:A细胞分泌了“某些东西”至培养基中,“这些东西”可以导致B出 ...

感谢你的分析,受教了。
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发表于 2015-12-11 20:51:33 | 显示全部楼层
niceman1987 发表于 2015-6-17 10:11
感谢你的分析,受教了。

受教了
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发表于 2016-1-28 13:58:04 | 显示全部楼层
谢谢楼主,收藏了
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发表于 2016-5-12 10:47:04 | 显示全部楼层
受益匪浅,非常感谢楼主!
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发表于 2016-7-8 15:22:30 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2015-6-16 16:23
第二种方法存在明显缺陷啊,该方法只能说明:A细胞分泌了“某些东西”至培养基中,“这些东西”可以导致B出 ...

版主你是如何解决两种不同细胞培养基不同的问题的呢?这样看来用A细胞的培养上清来培养B细胞,岂不是更加的方便,避免了两种不同培养基带来的麻烦。
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 楼主| 发表于 2016-7-10 09:07:10 | 显示全部楼层
stones 发表于 2016-7-8 15:22
版主你是如何解决两种不同细胞培养基不同的问题的呢?这样看来用A细胞的培养上清来培养B细胞,岂不是更加 ...

A和B的培养基如果可以一样,那自然是最好的了。如果不一样,我觉得也可以试试~
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发表于 2016-11-6 13:34:20 | 显示全部楼层
楼主 方便问一下您用的小室的货号吗
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