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楼主: hzangs

有囊泡相关技术问题请在该贴留言!

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发表于 2019-7-29 15:58:15 | 显示全部楼层
我发现我在1 ml PBS里加3-4 ul tween20,再上NTA测量,发现有很高浓度的颗粒,粒径可能小于100 nm,你们有人遇到过这个情况吗?这件事情的起因是我加了15% tween-20破坏外泌体后,稀释后上NTA,发现颗粒浓度还升高了。
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发表于 2019-11-19 13:26:52 | 显示全部楼层
Hzangs老师,有几个问题想请教您,万分感谢!!
1.外泌体做电镜的话需要做冷冻电镜吗?
2.外泌体提取出来之后大概可以在-80保存多久还能保持活性?如果提取出来先在4°放置两天再放到-80保存会会电镜或NTA鉴定有影响吗?
3,我用含有5%血清替代物的400ml细胞上清液提取外泌体,最后用100ulPBS重悬,检测NTA发现一点囊泡都没有,但是第一次同样的方法提取出来的200ml不含血清替代物的细胞上清,50u重悬后可以检测出来大约10的7次方个囊泡数,会是因为血清替代物的影响吗?
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 楼主| 发表于 2019-11-19 13:51:55 | 显示全部楼层
psyerLD 发表于 2019-11-19 13:26
Hzangs老师,有几个问题想请教您,万分感谢!!
1.外泌体做电镜的话需要做冷冻电镜吗?
2.外泌体提取出来之 ...

1、 负染即可。如果有条件 冷冻电镜也OK
2、-80可以长期保存,几个月没问题。 冷冻过的样品 可能会存在抱团   粒径增大等情况。
3、不是,大概率你都收丢了。 一般检测的囊泡数目 应该在10^9左右。你这比大家的数据低了2个数量级
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发表于 2019-11-19 14:52:31 | 显示全部楼层
hzangs 发表于 2019-11-19 13:51
1、 负染即可。如果有条件 冷冻电镜也OK
2、-80可以长期保存,几个月没问题。 冷冻过的样品 可能会存在抱 ...

谢谢hzangs老师!!我看了您在杭州的那个课件,里面写了超离最后一步不要倒出上清,意思就是这一步操作的时候我用移液管将上清吸走吗?
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 楼主| 发表于 2019-11-19 18:54:53 | 显示全部楼层
psyerLD 发表于 2019-11-19 14:52
谢谢hzangs老师!!我看了您在杭州的那个课件,里面写了超离最后一步不要倒出上清,意思就是这一步操作的 ...

是的,
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发表于 2019-11-20 09:05:26 | 显示全部楼层
hzang老师您好,我想问一下,我是用植物提取的外泌体,一直没找到鉴定蛋白的marker,只做了电镜和NTA,不知道蛋白这块该怎么鉴定,希望老师指导下
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 楼主| 发表于 2019-11-20 09:57:20 | 显示全部楼层
18331131398 发表于 2019-11-20 09:05
hzang老师您好,我想问一下,我是用植物提取的外泌体,一直没找到鉴定蛋白的marker,只做了电镜和NTA,不知 ...

植物方面,我关注的很少。一般认为  植物方面释放的 只能叫做囊泡,不叫外泌体。 你可以参考一下相关的文章  看看他们怎么鉴定的。  植物蛋白跑WB  比较难, 如果其他论文也没有WB鉴定,你可以考虑不做这个实验。
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发表于 2019-11-20 16:29:31 | 显示全部楼层
hzangs 发表于 2019-11-20 09:57
植物方面,我关注的很少。一般认为  植物方面释放的 只能叫做囊泡,不叫外泌体。 你可以参考一下相关的文 ...

好的,谢谢老师
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发表于 2019-11-20 18:55:26 | 显示全部楼层

好的!谢谢大神!
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发表于 2019-12-1 17:30:01 | 显示全部楼层
hzangs大神好!我的实验是比较提出来的外泌体内的蛋白含量差异,用Elisa来做,想请问hzangs大神,
1.在elisa前用什么来裂解外泌体比较好呢?用M-PER还是RIPA加蛋白酶抑制剂呢?我是小白所以不太懂
2.用试剂盒提出来的外泌体肯定会有杂蛋白存在,我怎样确保杂蛋白不会影响后面的elisa结果呢?是不是使用蛋白酶k?
谢谢!
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