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提取的外泌体目的是用于总RNA提取,哪个品牌的试剂盒好.....

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发表于 2015-8-4 11:10:30 | 显示全部楼层 |阅读模式
各位好,本人打算开展EXO RNA的相关工作,在版主“惜名”一篇帖子http://www.exosome.com.cn/forum. ... &extra=page%3D1比较几种提取方法,分离的EXO目的都是后期开展蛋白相关实验用的,我想问有没有兄弟姐妹用试剂盒分离EXO后接着提取总RNA ,哪个盒子好一些?  感谢    我看到目前关于EXO的盒子品牌主要有:SBI、101bio、Izon、life、Qiagen等
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发表于 2015-8-4 11:43:57 | 显示全部楼层
本帖最后由 惜名 于 2015-8-4 11:45 编辑

我是惜名。
“后期展开蛋白实验”事实上只是exo研究的第一步:用western鉴定exo表面marker。
鉴定完成后,后面的才可以称之为”后续功能研究“,目前比较流行的还是miRNA、而非蛋白。
因此,不少人提取exo后做miRNA芯片、找差异表达的miRNA、然后进一步做功能,最终证明exo可以通过某个miRNA完成某个作用。

当然,蛋白也是可以做的。
exosoem表面有蛋白,这些蛋白有些是marker,但也有一些具有功能,譬如有研究认为exo表面有AT1R、有TNF-a,可以直接与靶细胞上的配体结合发挥作用。
----------------------------------------------------------------------------
获得exo后,怎样提取总RNA?
我做过一次,用101bio的配套试剂盒,但是效果不好。或许是因为我的exo量太少、或许是后面引物不好,总之跑qPCR的CT值很高,不忍直视(提取miRNA后我没测浓度)。。。
后来,我索性直接找公司做的,bioTNT,之前找他们做过elisa和蛋白芯片,觉得还不错,于是我提取了exo直接给他们,让他们帮我提miRNA、并且接着跑miRNA,效果还不错,部分miRNA的CT值很高、在30以上,也有几个在20以内(我跑了8个miRNA,从相关文献里选择出来的)。
遗憾的是,我没问他们提取完miRNA是否测了浓度、也没问他们用了什么试剂盒提取的miRNA。。。
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 楼主| 发表于 2015-8-4 20:41:34 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2015-8-4 11:43
我是惜名。
“后期展开蛋白实验”事实上只是exo研究的第一步:用western鉴定exo表面marker。
鉴定完成后, ...

非常感谢惜名的详细回复,感谢!
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发表于 2015-8-27 13:02:26 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2015-8-4 11:43
我是惜名。
“后期展开蛋白实验”事实上只是exo研究的第一步:用western鉴定exo表面marker。
鉴定完成后, ...

1ml血中一般能提取多少exosomes RNA?
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发表于 2015-8-27 16:38:47 | 显示全部楼层
harevin 发表于 2015-8-27 13:02
1ml血中一般能提取多少exosomes RNA?

不知道  没提过。。。
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发表于 2015-9-14 17:07:16 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2015-8-4 11:43
我是惜名。
“后期展开蛋白实验”事实上只是exo研究的第一步:用western鉴定exo表面marker。
鉴定完成后, ...

惜名版主,以你现在的经验,能再谈谈这几个问题吗?
1、用多少量的exo,开始进行提取总RNA或miRNA的工作,比较合适?
2、有推荐的试剂盒吗?
谢谢~
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发表于 2015-9-15 08:53:21 | 显示全部楼层
kadak007 发表于 2015-9-14 17:07
惜名版主,以你现在的经验,能再谈谈这几个问题吗?
1、用多少量的exo,开始进行提取总RNA或miRNA的工作 ...

exo里面的RNA,我只做过一次,并且效果不好。
后来,我就直接把exo沉淀送给公司,让他们帮我提RNA、逆转录然后跑PCR了。
我送了大约4ml上清提出来的exo(SBI法)。

这4ml上清是用VIVO无血清培养基培养的,树突状细胞(DC)
根据前面做的浓度测定,exo量估计在10ug左右~
前几天,经Johhny版主证实,DC的分泌能力的确比较强,大约是干细胞的5倍左右~
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发表于 2015-9-15 09:48:46 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2015-9-15 08:53
exo里面的RNA,我只做过一次,并且效果不好。
后来,我就直接把exo沉淀送给公司,让他们帮我提RNA、逆转 ...

谢谢惜名~
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发表于 2015-9-18 16:59:05 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2015-8-4 11:43
我是惜名。
“后期展开蛋白实验”事实上只是exo研究的第一步:用western鉴定exo表面marker。
鉴定完成后, ...

惜名版主,请教下实验设计的问题
我现在也是通过查文献找到10来个miRNA,订购引物,从exo中提取总miRNA,合成cDNA,pcr扩增后,看看效果怎样,看能否从中找出几种miRNA进行后续功能研究。

问题是,我的exo是单一的胰腺癌来源,需要另外用正常的胰腺组织作为对照吗?对照的目的是避免出现这种情况:通过PCR筛选出的miRNA其实在胰腺正常组织中也是高表达的。

因为这10来种miRNA都是通过特定研究方向的文献查找出的,能否有效避免没有对照的风险?版主,你怎么看?请指点下,谢谢~
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发表于 2015-9-18 19:11:03 | 显示全部楼层
我个人觉得,对照组肯定要有啊。。。
有没有正常的胰腺细胞可以作为对照呢?
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