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miRNA引物自己设计靠谱吗?

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发表于 2015-9-2 14:27:37 | 显示全部楼层 |阅读模式
请教下各位,从exo中提取miRNA,逆转为cDNA, 再行PCR,我所用的试剂盒不提供miRNA的上游引物,
你们是从公司直接订购miRNA引物,还是自己设计好让公司合成呢?
网上有很多miRNA引物设计的信息,看起来挺简单,不知道可靠性怎样......
给点建议把,谢谢~

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发表于 2015-9-5 10:43:39 | 显示全部楼层
kadak007 发表于 2015-9-3 21:51
版主,麻烦看下这个设计方法靠谱吗? 可行的话我就按这个办

以hsa-miR-145为例设计引物,其成熟体序列 ...

下面是我们实验室microRNA的引物设计的方法,他们就是按照这个方法设计的

hsa-miR-145为例设计引物,其成熟体序列为:GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU
反向引物:每个反向引物都带有一段固定的序列,可以形成一个茎环,
固定的序列为:5-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3
在这个序列后加上八个碱基,这八个碱基是hsa-miR-145从后面数八个碱基的反向互补序列,就是GAAUCCCU的反向互补:AGGGATTC,最后得到的反向引物的序列为
5-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGGGATTC -3


正向引物:每个正向引物也带有一段固定的序列,固定的序列为:ACACTCCAGCTGGG

在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列,成熟体除掉后面六个碱基后序列为:GUCCAGUUUUCCCAGGA,把U变成T即可,最后的序列为:

5’-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA -3

Universal Reverse Primer:统一反向引物也是一段固定的序列,TGGTGTCGTGGAGTCG

U6引物F-CTCGCTTCGGCAGCACAR-AACGCTTCACGAATTTGCGT

使用方法:

1逆转的引物:所有要做的miRNA反向引物的混合,每个10微升

2 PCR的引物:50微升的体系,30微升的水,10微升的正向引物,10微升的URP

Sequence-specific reverse primers:前缀序列并不是通用的,对有的microRNA可能不适用,就得换一条前缀序列
ABI microRNA 引物设计范例:
前缀序列:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC######44nt
Reverse primerGTGCAGGGTCCGAGGT
  
miRNA ID
  
Primer/probe
Sequence
lin-4
RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACAC
Forward primer
GCCCTCCCTGAGACCTCAA
Reverse primer
GTGCAGGGTCCGAGGT
TaqMan probe
(6-FAM)TGGATACGACTCACACTT(MGB)
miR-7
RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACAAA
Forward primer
CGGCGGTGGAAGACTAGTGATT
Reverse primer
GTGCAGGGTCCGAGGT
TaqMan probe
(6-FAM)TGGATACGACAACAAA(MGB)
miR-10a
RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACAAA
Forward primer
TGCGGTACCCTGTAGATCCG
Reverse primer
GTGCAGGGTCCGAGGT
TaqMan probe
(6-FAM)TACGACCACAAATTC(MGB)
miR-10b
RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAT
Forward primer
TCGGGTACCCTGTAGAACCG
Reverse primer
GTGCAGGGTCCGAGGT
TaqMan probe
(6-FAM)TACGACACAAATTCG(MGB)
miR-16
RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA
Forward primer
CGCGCTAGCAGCACGTAAAT
Reverse primer
GTGCAGGGTCCGAGGT
TaqMan probe
(6-FAM)ATACGACCGCCAATAT(MGB)
miR-20
RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTACCTG
Forward primer
GCGGCGGTAAAGTGCTTATAGTG
Reverse primer
TGCAGGGTCCGAGGTAT
TaqMan probe
(6-FAM)CTGGATACGACTACCTG(MGB)
miR-21
RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA
Forward primer
GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG
Reverse primer
GTGCAGGGTCCGAGGT
TaqMan probe
(6-FAM)CTGGATACGACTCAACA(MGB)
miR-22
RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGTT
Forward primer
GCCTGAAGCTGCCAGTTGA
Reverse primer
GTGCAGGGTCCGAGGT
TaqMan probe
(6-FAM)TGGATACGACACAGTTCT(MGB)
miR-26b
RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCTAT
Forward primer
CGCCGCTTCAAGTAATTCAGGAT
Reverse primer
GTGCAGGGTCCGAGGT
TaqMan probe
(6-FAM)CACTGGATACGACACCTA(MGB)
miR-30a-3p
RT
GTCGTATCCAGTCCAGGGACCGAGGACTGGATACGACGCTGC
Forward primer
AGCCGCTTTCAGTCGGATGTTT
Reverse primer
TCCAGGGACCGAGGA
TaqMan probe
(6-FAM)CTGGATACGACGCTGC(MGB)
miR-30a-5p
RT
GTCGTATCGAGTGCAGGGACCGTGGTCTCGATACGACGCTTC
Forward primer
GCGTGTAAACATCCTCGACTGG
Reverse primer
GCAGGGACCGTGGT
TaqMan probe
(6-FAM)TCGATACGACGCTTCC(MGB)
let-7a
RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTA
Forward primer
GCCGCTGAGGTAGTAGGTTGTA
Reverse primer
GTGCAGGGTCCGAGGT
TaqMan probe
(6-FAM)TGGATACGACAACTATAC(MGB)
let-7b
RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAATCAC
Forward primer
GCCGCTGAGGTAGTAGGTTGTGT
Reverse primer
GTGCAGGGTCCGAGGT
TaqMan probe
(6-FAM)CTGGATACGACAATCAC(MGB)
let-7c
RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACCAT
Forward primer
GCCGCTGAGGTAGTAGGTTGTA
Reverse primer
GTGCAGGGTCCGAGGT
TaqMan probe
(6-FAM)TGGATACGACAACCAT(MGB)
let-7d
RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTATG
Forward primer
GCCGCAGAGGTAGTAGGTTGC
Reverse primer
GTGCAGGGTCCGAGGT
TaqMan probe
(6-FAM)TGGATACGACACTATGC(MGB)
let-7e
RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTATA
Forward primer
TGCCGGTGAGGTAGGAGG
Reverse primer
GTGCAGGGTCCGAGGT
TaqMan probe
(6-FAM)TGGATACGACACTATACA(MGB)
miR-2
RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCACAT
Forward primer
GCCCGTATCACAGCCAGCTT
Reverse primer
GTGCAGGGTCCGAGGT
TaqMan probe
(6-FAM)ACGACGCACATCAA(MGB)

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发表于 2015-9-2 22:12:30 | 显示全部楼层
靠谱!我们实验室做miRNA的都是自己设计引物的
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 楼主| 发表于 2015-9-3 21:51:57 | 显示全部楼层
Johnny 发表于 2015-9-2 22:12
靠谱!我们实验室做miRNA的都是自己设计引物的

版主,麻烦看下这个设计方法靠谱吗? 可行的话我就按这个办

以hsa-miR-145为例设计引物,其成熟体序列为:GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU。
每个正向引物带有一段固定的序列,固定的序列为:GGG
在这个序列后加上于成熟体 除后面6个外 剩下的碱基序列,成熟体除掉后面6个碱基后序列为:GUCCAGUUUUCCCAGGA,把U变成T即可,最后的序列为:5,-GGG GTCCAGTTTTCCCAGGA -3,
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 楼主| 发表于 2015-9-5 18:01:37 | 显示全部楼层
Johnny 发表于 2015-9-5 10:43
下面是我们实验室microRNA的引物设计的方法,他们就是按照这个方法设计的

以hsa-miR-145为例设计引物, ...

很详细很给力,谢谢版主指导~
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发表于 2015-9-5 18:46:16 | 显示全部楼层
kadak007 发表于 2015-9-5 18:01
很详细很给力,谢谢版主指导~

不客气~~~~~~~~~~
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 楼主| 发表于 2015-9-7 10:40:18 | 显示全部楼层

版主,关于引物设计的后续规范再麻烦下:
我所用的miRNA荧光定量检测试剂盒已提供下游引物,估我只需提供上游引物序列,以hsa-mir-145为例,即提供5’-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA -3即可
1、公司要求提供 OD值 和 纯化方式。这个怎么写?有惯例吗?
2、我用的试剂盒提供的下游引物Tm值65℃,故建议上游引物Tm值为65℃左右。我用DNAstar检测引物,Tm值为72.7℃。那我只保留固定序列中的一部分(AGCTGGG ),使TM值为64.6℃。这样做可行吗?
麻烦指导下,谢谢~~
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发表于 2015-9-7 19:45:55 | 显示全部楼层
kadak007 发表于 2015-9-7 10:40
版主,关于引物设计的后续规范再麻烦下:
我所用的miRNA荧光定量检测试剂盒已提供下游引物,估我只需提供 ...

OD值我们一般是4。纯化方式是PAGE。

Tm值差别大没关系,能P出来就行
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 楼主| 发表于 2015-9-7 19:52:40 | 显示全部楼层
Johnny 发表于 2015-9-7 19:45
OD值我们一般是4。纯化方式是PAGE。

Tm值差别大没关系,能P出来就行

好的,多谢~
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发表于 2016-5-27 13:43:37 | 显示全部楼层
Johnny 发表于 2015-9-7 19:45
OD值我们一般是4。纯化方式是PAGE。

Tm值差别大没关系,能P出来就行

版主,颈环引物设计好随便交给哪个公司都可以吗?还是说要送给特定的公司设计才能用啊?
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