外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

 找回密码
 立即注册
查看: 151|回复: 3

关于血浆外泌体提取的疑问

[复制链接]

1

主题

24

帖子

316

积分

中级会员

Rank: 3Rank: 3

积分
316
发表于 2020-10-12 10:06:43 | 显示全部楼层 |阅读模式
本文前后提取过几次血浆外泌体,流程如下:
小鼠眼眶取血,3000g*30min,13000g*30min,-20保存;超高速离心前融化13000*10min,合并小鼠血浆,贝克曼15ml规格离心管,加入3ml左右血浆和12mlPBS,然后110000g*2h,完成后吸取上清(留下底部2-3ml),加入12-13mlPBS,110000g*70min,完成后小心吸去或倒掉上清液,加入50μlPBS重悬。
问题是:1,血浆冻融后会有白色或透明胶质样物质(应该是血浆中的纤维蛋白成分),13000g并不能使其完全沉底,导致部分混入最终110000g的超高速离心,而最终与底部外泌体混在一起。
2,外泌体离心全程不可见,并不清楚整个过程操作是否正确,最终样本是否真的含有外泌体,western检测显示有阳性蛋白,但因为血浆来源且并不纯,阴性蛋白也显示阳性。而电镜或者NTA暂时不具备实验条件
想知道各位大佬提取血浆外泌体时候是否遇到过问题1中的胶质样物质以及如何解决,或者超高速离心提取外泌体时是否能肉眼观察到离心管底的外泌体。
谢谢。
回复

使用道具 举报

5

主题

48

帖子

407

积分

中级会员

Rank: 3Rank: 3

积分
407
发表于 2020-10-12 11:05:19 | 显示全部楼层
我觉得你可以把血浆先稀释后在进行后续的离心,防止由于血浆蛋白浓度过高与纤维蛋白一起聚沉,超离前还是有必要进行适当的高速离心。个人观点仅供参考,外泌体的三个鉴定实验是相辅相成的尽量还是都做了才能说明问题。
回复 支持 反对

使用道具 举报

1

主题

24

帖子

316

积分

中级会员

Rank: 3Rank: 3

积分
316
 楼主| 发表于 2020-10-13 08:45:44 | 显示全部楼层
ij1211 发表于 2020-10-12 11:05
我觉得你可以把血浆先稀释后在进行后续的离心,防止由于血浆蛋白浓度过高与纤维蛋白一起聚沉,超离前还是有 ...

谢谢,我超离心的时候用的是贝克曼15ml的管子,就是3ml血浆+12mlPBS来离心的,您的意思是超高速离心前置步骤离心的时候就进行PBS稀释吗
回复 支持 反对

使用道具 举报

1

主题

24

帖子

316

积分

中级会员

Rank: 3Rank: 3

积分
316
 楼主| 发表于 2020-10-14 10:12:15 | 显示全部楼层
求各位大佬指点一下呀呀呀呀
回复 支持 反对

使用道具 举报

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

关闭

站长推荐上一条 /1 下一条

QQ|Archiver|手机版|外泌体之家 | exosomes & microvesicles  

GMT+8, 2020-10-31 23:27 , Processed in 0.107485 second(s), 8 queries , File On.

Powered by Discuz! X3.3

© 2001-2017 Comsenz Inc.

快速回复 返回顶部 返回列表