大家关于试剂盒的几点疑问和澄清

hzangs

seallin 发表于 2015-10-26 14:43
大家互相交流，才能碰撞思维的火花。
其实kit提取的蛋白里有很多杂蛋白，是因为有血清的残留，不是因为聚 ...

很高兴能和你交流这些东西。

请问 有尝试过将kit沉淀的东西重新溶解然后再用kit沉淀一遍么， 结果如何， 是不是真的蛋白含量就少了， 现在有这方面的数据吗？  我也曾经尝试过将用kit 沉淀，但是沉淀出来之后并不只是蛋白含量很大，而且底部的pellet也很多，要比超离明显多很多。这也说明，杂蛋白确实是在沉淀里的，不仅仅是在管壁上的。
24h和10h处理血清来说   这个我都没有尝试过，不知道你尝试过没有。 我的血清都是使用12Wg 超离14-16小时（overnight）处理的。 关于2小时是否可以完全沉淀培液中的exosomes， 这个实验我还是验证过的。 11w g 70min超离后的上清再超离 确实不会再有沉淀， 说明沉淀还是相对比较充分的。
文献里要求血清过夜超离的原因主要是因为血清相对于培液来说要粘稠很多，所以可能需要更长的时间才会成分沉淀其外泌体，达到去除的目的。

如果没有记错的话，楼主应该是化物所的吧，还希望楼主能详细的解释一下PEG-base的沉淀试剂盒 沉淀分离exosomes的具体原理~

hzangs

seallin 发表于 2015-10-26 15:46
我也很高兴能与您探讨！
再来一遍的话，如果跑胶对比，可以明显发现60-70kDa的条带变浅了很多，因为血清 ...

两次沉淀， 收到的沉淀 蛋白定量  和超离定量  会有多大差距？  这个我还真没做过呢~ 因为杂蛋白的问题，并且我确实发现kit沉淀分离的所谓的外泌体  对我的实验有影响并且会带来假阳性结果  所以我才极力反对沉淀法的kit。
你认为PEG-base的沉淀试剂盒的沉淀原理是什么呢？

hzangs

目前我不建议大家用沉淀试剂盒分离的最主要原因有二：
1、我曾经将life的试剂盒沉淀的所谓的外泌体和超离的外泌体同时做实验，kit沉淀的 出现了假阳性。
2、坛子里的朋友，有人使用kit分离外泌体做实验，然后投paper的时候被reviewer质疑了。
正因为基于上述的两方面问题，
以及直观的观察，kit沉淀的量要远远的多于超速离心法分离出来的沉淀量，而超离分离所得到的又是培液里几乎所有的exosomes了，所以我直观的认为，沉淀法分离的所谓的外泌体中应该有着大量的杂蛋白。

综合上面的这些原因， 所以建议大家不要用沉淀法的kit~~

hzangs

seallin 发表于 2015-10-26 16:55
恩，我理解你的想法，对于后续需要用到exo的实验，还是超离最好，这点我认同。试剂盒缺点确实比较多：1、 ...

部分同意你的观点。但是如果后期是用来做蛋白质谱或者脂类的话，我同样是不建议使用kit。 如果后期是用来做大规模的seq，可以考虑，毕竟培液里游离的RNA相对来说比较少。同时，我并不认为沉淀法的kit 有什么优势。当我用life的kit时候，从离心机把管子拿出来，看到那一堆沉淀的一刹那，我就感觉，这个太扯了。。。 沉淀量足足有超离分离的上百倍。。。。。。

hzangs

seallin 发表于 2015-10-26 17:17
嗯呢，但是如果24h离心的血清培养细胞后，用kit沉淀会很少~~~~因为那次，我都惊呆了，本以为会很多，结果 ...

但是你的这个实验并不能证明什么啊……

我认为楼主只需要拿出一个数据即可：kit第一次沉淀下来的东西里，外泌体占的百分比，第二次kit沉淀时外泌体占的百分比，超离分离法得到的沉淀，外泌体所占的百分比（可以以粒子数/微克蛋白表示，也可以用wb上样一样多的蛋白杂marker看亮度表示）。这个数据就完全可以解释 到底kit沉淀法有没有沉淀出大量的杂蛋白。 （这才是最直接的证据，而其他的东西都或多或少带有主观推断）

咱俩争论来争论去，这个数据才是最重要的。 (Lobb RJ Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma, J Extra Vesc, 2015)这篇paper里已经做过第一次沉淀的比较了。你只要做一下第二次的比较即可。 或者你可以通过数据推翻这篇paper的结论 也可以的~

hzangs

seallin 发表于 2015-10-27 17:04
不过不是用SBI提取的，是自己加聚合物提取的。第一次沉淀后去除上清，加水或PBS重溶，再加一定比例的聚合 ...

其实 我还是建议楼主去考察一下   粒子数/蛋白 这个值，  这个反映比较直观，说服力也比较强。

hzangs

seallin 发表于 2015-10-27 21:20
如果我是你们一线城市就好了，上次去测NTA都是从东北飞到上海去测的，第三次报销的时候看老师脸都绿了。 ...

你可以联系一下izon 或者 nanosight，已合作的方式，到时候发文章方法里写一下的形式体现合作，也许他们可以免费给你测呢~  邮递样品就可以。  我找izon的qNano测粒子浓度的时候 就是邮递过去的，冰袋加厚泡沫盒就行的~~

hzangs

seallin 发表于 2015-10-28 10:17
有点疑问，文献他们用的仪器是TRPS（qnano的），测量粒径的时候单位是1E11 particles/mL，这太高了吧，我 ...

对不起刚刚发出的帖子  我感觉有点不妥当，所以对一些数值进行修正。考虑到A549平铺在培养皿中是50um，球形的状态不好估算，所以我们按照真核细胞平均直径计算吧。

真核细胞的平均直径在30um。 exosome的直径我们取一个比较大的值100nm，也就是0.1um。真核细胞直径就是exosome的300倍，面积就是90000倍，体积就是27000000倍。也就0.27 E8 倍.

那么 E8的exosomes的体积不及4个真核细胞。  试想，我们能隔着离心管壁看到4个沉淀在管底的细胞么？

我60ml 培液收到的exosomes，200um的体积重悬，测粒子数在E11左右， 体积也仅仅相当于不到4000个细胞。考虑到我在离心管底部看到的芝麻大小薄薄的一层沉淀。这里的数据属于估算，真实情况可能存在出入 但是足以说明问题。所以我感觉E11的值属于正常，反而E6-E8有点偏小了

hzangs

onlyrush 发表于 2015-10-28 10:58
PEG沉淀的方法以前用于病毒的浓缩，我的实验也显示，在有病毒粒子存在的情况下Life的试剂盒把exosomes与病 ...

PEG促沉淀 一般考虑是它竞争性结合游离水

hzangs

seallin 发表于 2015-10-28 15:11
你的例子还有数值很有道理，请问你60ml培养液最后得到多少微克蛋白？另外马尔文的仪器在测试的时候，一旦 ...

这个涉及到了我们细胞系的特性和后面发表时候的相关数据，所以具体细节不便透露，还请见谅。 因为不是用的马尔文的仪器，所以不存在1E9这个界限。确实稀释了，但是稀释倍数也只能暂且保密，毕竟我已经将粒子数的数据放出来了。 还望见谅