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Nature:系统解析miRNA分选进入细胞外囊泡的机制,为细胞外囊泡装载核酸药物用于疾病治疗打开想象空间 (文末可下载全文)

细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EV)是一种由细胞释放的脂双层膜包裹的纳米囊泡,几乎所有的细胞都能够释放细胞外囊泡。近些年的研究已经证明细胞外囊泡在各种复杂的生理和病理过程中发挥着重要的作用。细胞外囊泡通过携带并在细胞间传递miRNA参与细胞间信号转导是其发挥功能的主要策略之一。虽然已有繁多的研究报道细胞外囊泡miRNA在各种生理病理中的功能机制,但是miRNA筛选进入细胞外囊泡的具体机制并不清楚。近日,来自哈佛大学医学院加州巴克老化研究所的研究人员通过对细胞驻留和细胞外囊泡富集miRNA的序列分析及具体蛋白和核酸基序的实验验证系统性的阐释了miRNA分选进入细胞外囊泡的具体机制,初步阐释了细胞外囊泡miRNA的分选系统,相关研究成果以“MicroRNAsequence codes for small extracellular vesicle release and cellular retention”[1]为题于12月22日在Nature在线发表。
为了研究细胞驻留miRNA和细胞外囊泡富集miRNA的具体特征,研究者们从3T3-L1分化的白色脂肪细胞、棕色脂肪细胞、永生化脂肪细胞以及C2C12(骨骼肌)细胞、SVEC(内皮)细胞和 AML12 细胞(肝细胞)多个小鼠细胞系培养基中通过差速超速离心及超速离心联合凝胶排阻层析分离纯化了细胞外囊泡。并通在经典的验证实验证实这些细胞外囊泡直径分布在50-200 nm,富含经典ALIX、TSG101、CD9 和 CD63标志物,并且相关阴性指标GM130和CANX19呈现阴性。使用基于实时定量PCR (qPCR)的阵列评估分析了分泌的细胞外囊泡及其来源细胞的miRNA组成,结果证实了细胞外囊泡中富集的miRNA和细胞驻留的miRNA种类存在显著差异(图 A),并且细胞外囊泡富集的miRNA在不同细胞来源细胞外囊泡中呈现相似趋势,从而暗示了miRNA进入细胞外囊泡是存在主动分选机制的。
对细胞驻留miRNA和细胞外囊泡富集miRNA的分子种类进行分析发现,有43 个 miRNA 显着驻留在所有细胞类型的细胞体中,而 13 个 miRNA 在所有细胞类型的细胞外囊泡中都显着富集。此外,也有许多 miRNA 仅在一种细胞中表现出在细胞或细胞外囊泡中富集,这提示生物体中还存在细胞类型特异性的细胞驻留和细胞外囊泡富集的微调机制。为了阐释miRNA分选进入细胞外囊泡的具体机制,研究人员对相关miRNA的序列进行了分析并发现了诸多与细胞体驻留和细胞外囊泡富集相关的miRNA基序(图B)。改变特定miRNA的基序确实可以改变miRNA在细胞或细胞外囊泡中的富集情况(图C)。利用miRNA进行pull-down,研究者们发现了调控miRNA进入细胞外囊泡的具体分子机器(图D)。最后,通过实验,研究者们论证了为miRNA添加特定的基序促进其细胞外囊泡富集并调控受体细胞功能的可行性(图E)。(此外,该研究还通过详实的实验排除了诸如培养基血清、细胞外囊泡分离方法、PCR扩增非均一性原因对该研究结论的潜在干扰。)
编辑Hzangs按:
大量的研究报道介绍了细胞外囊泡miRNA参与生理病理调控过程,但是由于细胞外囊泡相关miRNA分选机制研究的空白导致细胞外囊泡miRNA功能研究成为了“空中楼阁”。针对细胞外囊泡miRNA是否真的具有广泛的功能也同样存在一些质疑声音。先前已有少量报道介绍特定蛋白可能参与了miRNA进入细胞外囊泡的分选过程,也有零星的文章介绍了个别miRNA进入细胞外囊泡的分选机制[2-6],但是依旧缺少miRNA进入细胞外囊泡机制的系统性阐释报道。这篇报道通过详实系统的组学数据以及严谨的实验论证证实了细胞外囊泡miRNA分选系统的存在及工作原理,为深入理解细胞外囊泡miRNA的功能机制提供了可靠的理论依据。
细胞外囊泡作为药物递送载体是近两年产业界开始关注的重要议题之一。由于缺乏对于细胞外囊泡装载RNA和蛋白机制的理解,工程化细胞外囊泡装载药物效率存在严重的瓶颈限制,通常只能通过电转等人为手段实现药物装载,如何提高药物装载效率是细胞外囊泡作为药物递送载体应用于临床前必须解决的问题。这篇文章所揭示的细胞外囊泡装载miRNA相关的蛋白机器及核酸基序为优化细胞外囊泡药物装载策略和提高细胞外囊泡药物装载效率提供了重要的理论支撑和策略选择。诸如为miRNA或编码蛋白的mRNA融合特定基序,为蛋白、脂质分子直接共价结合特定基序都是值得尝试的改善装载效率的潜在策略。
文章的数据同时提示了其他装载策略和机制的存在。未来对于该报道结果的可重复性验证及其他装载策略和机制的研究报道将极大的推动细胞外囊泡作为药物递送载体的产业化发展。这是近年来继外泌体GPC1作为胰腺癌标志物之后的又一改变细胞外囊泡研究领域现状的重磅报道。外泌体之家将持续关注相关领域的动态并为大家提供最新研究资讯。
注:这篇Nature报道为开源文章,大家可以访问论文页面进行阅读下载:https://www.nature.com/articles/s41586-021-04234-3。或登录外泌体之家论坛,在同名贴下载该论文:
参考文献:
[1]        Garcia-Martin R, Wang G, Brandao B B,Zanotto T M, Shah S, Kumar Patel S, Schilling B, Kahn C R. MicroRNA sequencecodes for small extracellular vesicle release and cellular retention [J].Nature, 2021.
[2]        Temoche-Diaz M M,Shurtleff M J, Nottingham R M, Yao J, Fadadu R P, Lambowitz A M, Schekman R.Distinct mechanisms of microRNA sorting into cancer cell-derived extracellularvesicle subtypes [J]. eLife, 2019, 8.
[3]        Shurtleff M J, Temoche-DiazM M, Karfilis K V, Ri S, Schekman R. Y-box protein 1 is required to sortmicroRNAs into exosomes in cells and in a cell-free reaction [J]. eLife, 2016,5.
[4]        Cha D J, Franklin JL, Dou Y, Liu Q, Higginbotham J N, Demory Beckler M, Weaver A M, Vickers K,Prasad N, Levy S, Zhang B, Coffey R J, Patton J G. KRAS-dependent sorting ofmiRNA to exosomes [J]. eLife, 2015, 4: e07197.
[5]        Villarroya-Beltri C,Gutierrez-Vazquez C, Sanchez-Cabo F, Perez-Hernandez D, Vazquez J,Martin-Cofreces N, Martinez-Herrera D J, Pascual-Montano A, Mittelbrunn M,Sanchez-Madrid F. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs intoexosomes through binding to specific motifs [J]. Nature communications, 2013,4: 2980.
[6]        Statello L, MaugeriM, Garre E, Nawaz M, Wahlgren J, Papadimitriou A, Lundqvist C, Lindfors L,Collen A, Sunnerhagen P, Ragusa M, Purrello M, Di Pietro C, Tigue N, Valadi H.Identification of RNA-binding proteins in exosomes capable of interacting withdifferent types of RNA: RBP-facilitated transport of RNAs into exosomes [J].PloS one, 2018, 13(4): e0195969.
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