刚跑了一次WB 为什么没结果

神外勇哥哥

本人是用英杰公司的试剂盒提取的外泌体，跑WB用的是abcam的小鼠cd63，当时加目标一抗稀释比例1比500，为什么跑出来β-actin有条带，而目标抗体没有，不知道哪个环节出了问题

hzangs

β-actin 属于高丰度的蛋白，很容易监测到的。 这个参考意义不大。
你可能需要考虑一下两个问题：
1、你起始抽提exosome 使用的样本是血清还是细胞上清，起始量多少毫升？细胞上清 太少的话  抽提不到的。
2、你的抗体是哪个公司的，抗体是否好用。

神外勇哥哥

hzangs 发表于 2016-4-4 14:07
β-actin 属于高丰度的蛋白，很容易监测到的。 这个参考意义不大。
你可能需要考虑一下两个问题：
1、你起 ...

我提的是炎症刺激星形胶质细胞的上清液，当时取了3瓶上清液，12ML总共，用的试剂盒提的，抗体是ABCAM的CD63，稀释比例选的一比五百，不懂是不是稀释浓度不够啊

hzangs

神外勇哥哥 发表于 2016-4-4 20:54
我提的是炎症刺激星形胶质细胞的上清液，当时取了3瓶上清液，12ML总共，用的试剂盒提的，抗体是ABCAM的CD ...

你上样蛋白 多少ug？

神外勇哥哥

hzangs 发表于 2016-4-4 21:15
你上样蛋白 多少ug？

蛋白具体含量没测，用BCA法显示有蛋白，主要就是求教我抗体稀释比例对嘛，有没有标准的参考

hzangs

神外勇哥哥 发表于 2016-4-5 09:28
蛋白具体含量没测，用BCA法显示有蛋白，主要就是求教我抗体稀释比例对嘛，有没有标准的参考 ...

你的抗体稀释比例没问题。  但是一般WB的抗体会按照1:1000--1:10000的比例稀释。没有必要1:500   
abcam  CD63 的抗体我的一个师妹用过，效果还可以的。

神外勇哥哥

hzangs 发表于 2016-4-5 09:36
你的抗体稀释比例没问题。  但是一般WB的抗体会按照1:1000--1:10000的比例稀释。没有必要1:500   
abcam  ...

好的 多谢啦 在问一下一般试剂盒离心出来的外泌体能看的到沉淀嘛，如果看不到是不是量不够

fight2015

hzangs 发表于 2016-4-5 09:36
你的抗体稀释比例没问题。  但是一般WB的抗体会按照1:1000--1:10000的比例稀释。没有必要1:500   
abcam  ...

请问ab抗CD63一般稀释到多少。

hzangs

fight2015 发表于 2016-4-5 12:00
请问ab抗CD63一般稀释到多少。

这个要看你的抗体说明书里的建议稀释倍数。
一般我们实验室习惯上跑WB，大公司的抗体稀释1:2000-5000    小公司的抗体 1:1000

hzangs

神外勇哥哥 发表于 2016-4-5 11:50
好的 多谢啦 在问一下一般试剂盒离心出来的外泌体能看的到沉淀嘛，如果看不到是不是量不够 ...

如果你是用的是invitrogen那款沉淀试剂盒， 没有看到沉淀的话  你可能没有拿到任何东西。
沉淀试剂盒往往都会拿到明显的沉淀，那些沉淀里有一定含量的exosome