第一次超离心WB结果，求大神帮忙看一看

dengsilong1991 · 发表于 2016-5-26 16:20:28

第一次用超离心分离exo，离心程序2000g 20min-10000g 30min-100000g 2h-100000g 2h，离心后沉淀很少，用80ulPBS重悬后，加入loading buffer，95度 5min煮，然后按6ul 8ul 10ul上样，用calnexin、TSG101、CD9杂条带，结果可以看到，cal仍然存在说明exo不纯，TSG101显出了条带，但CD9完全没有显出(CD9抗体之前有用别的蛋白验证过，没有问题)。想求问一下各位大神，超离心后的exo的WB是否可以做出干净的条带(无阴性marker)？或者是需要进一步纯化才行？另外，我之前试过小鼠血清提取的exo，CD9也很淡；这次用的是CHO细胞，完全没有CD9，是不是CD9在这些exo可能没有表达？谢谢！！

dengsilong1991 · 发表于 2016-5-27 15:19:46

hzangs 发表于 2016-5-26 20:12
你这个怎么没有 cell lysis的对照…… 没有细胞对照不好讲啊……

因为是第一次超离，我的培养基还是多次收集的，想看看离心所得物怎么样。cell lysis的对照可以反应分离的exo的纯度吗？分离的exo的阴性marker要怎样才能除去呢？请前辈赐教。

dengsilong1991 · 发表于 2016-5-27 15:34:43

恩，好的，我这次离心把cell也带上，谢谢前辈！

dengsilong1991 · 发表于 2016-6-23 09:32:40

小孔加油发表于 2016-6-22 20:35
请问您一次超离多少培养基得到的外泌体，才能保证做western的量？谢谢！

我也才超离过三次，前两次是60ml离心，80ul溶解，直接loading buffer煮后，10ul上样，能见条带

dengsilong1991 · 发表于 2016-6-27 16:04:09

胖子的心境发表于 2016-6-23 15:48
都不用裂解，直接煮吗？？？？？

是的，直接加buffer煮

dengsilong1991 · 发表于 2016-7-7 11:05:55

小孔加油发表于 2016-7-4 15:34
您好，想请教一下,是，离心之后，用80ul PBS溶解，80ul里加多少loading buffer煮的呢？PBS能换成蛋白裂解液 ...

我用的是4xloading buffer，所以80里面加27就行了，蛋白裂解液是5x的，所以也得用PBS稀释啊

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