外泌体提RNA浓度很低，qPCR循环数35左右，曲线良好，但觉...

cherry

如题，像大家所反映的外泌体RNA浓度低，大概20~ 50ng/μL ，A260/A280 1.2~1.7左右，做过好几次，但每次qPCR 循环数都30以上，老师说量太少，A260/280低说明不纯，反转录cDNA量不一致，不能说明问题，大家有什么更好的解决方案么？最近尝试加大上清量试一试。欢迎交流~

hzangs

用10-20ul 水重悬， 浓度尽量保证在100ng/ul   
因为浓度低 所以260/280的值不是很正常，因此这个比值可以不做参考，Qiagen的kit抽提的RNA 这个值也在1.6附近。
一般 GAPDH的CT值可以跑到20左右甚至更低

grapetian

hzangs 发表于 2016-7-11 10:52
用10-20ul 水重悬， 浓度尽量保证在100ng/ul   
因为浓度低 所以260/280的值不是很正常，因此这个比值可以 ...

你好 我想问你们是用什么提rna?我想提细胞培养上清外泌体的rna用哪个试剂盒比较好？还是直接提exosome后加trizol提取？我看sbi和qiagen的都是提血清或血浆的外泌体rna

yxy999

完颜云裳 发表于 2016-8-16 23:19
感谢楼主的分享,我们做的是病人血清,一管500ul。这样一来结果就能解释了。

请问你们ct值大概多少呀

啊哈哈啊哈哈

大神们，请问外泌体RNA的浓度能反应外泌体的浓度高低吗？

kundoctor

烟尽云淡 发表于 2017-9-2 20:39
hzangs大神，看到您说用trizol提外泌体RNA效果还可以，想向您咨询请教一下。我是先用超离提外泌体，再用t ...

请问你得到的RNA  A260/280是多少？
我用肿瘤细胞上清液提，约400ml，过程一样，Takara的RNaiso plus 提, 最后得到RNA为浓度100ng左右，有时候达到150ng，但是A260/A280一直都 是1.5左右。

urology_gxl

外泌体miRNA 你们内参用U6吗？

烟尽云淡

hzangs 发表于 2016-7-11 10:52
用10-20ul 水重悬， 浓度尽量保证在100ng/ul   
因为浓度低 所以260/280的值不是很正常，因此这个比值可以 ...

hzangs大神，看到您说用trizol提外泌体RNA效果还可以，想向您咨询请教一下。我是先用超离提外泌体，再用trizol提RNA，但RNA浓度一直很低，150ml细胞上清提外泌体，最后提取的rna用10ul 水溶解，用nanodrop测浓度在50ng/ul左右。很困惑，我的外泌体的提取也是按照经典的300g，10min；2000g，10min；10000g，30min；100000g，90min 两遍操作的，RNA的提取步骤大概如下：
1、向重悬得到的外泌体溶液（200ul）中加入1ml Trizol，反复吹打混匀，室温放置10min。
2、按比例加入氯仿200ul，剧烈涡旋振荡，4℃放置10min。
4、4℃ 12000g，离心15min。
5、小心吸取上层水相至新EP管（500ul-700ul）。
6、1：1加入异丙醇500ul-700ul，混匀，-20℃放置30min（想着低温、延长时间能增加rna富集）。
7、4℃ 12000g 离心10min，弃上清，RNA 沉于管底。
8、加入75%乙醇1ml，温和振荡。
9、4℃ 12000g 离心 5min，弃上清，晾干
10、加用10-20ul RNAse-free 水溶解沉淀RNA（室温），测浓度
麻烦啦

konggy

楼主能分享一下是用什么方法富集的外泌体吗。

wintersweet_d

grapetian 发表于 2016-7-11 19:31
你好 我想问你们是用什么提rna?我想提细胞培养上清外泌体的rna用哪个试剂盒比较好？还是直接提exosome后 ...

Qiagen那个也可以提细胞系的外泌体，我提过

完颜云裳

感谢楼主的分享,我们做的是病人血清,一管500ul。这样一来结果就能解释了。

cherry

完颜云裳 发表于 2016-8-10 23:36
楼主后面加大上清量结果有改善吗？我跑的结果也是这样，关键是U6也到了30几个循环了 ...

加大上清有改善，真的，因为我们样本量太小了，能养多少细胞别客气，尽量养，多收上清，他们上清用得比较少做出来是因为有一些是分泌型细胞，我的是一般肿瘤细胞，这次是100ml 收的U6 循环数22左右