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PKH26和PKH67标记

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发表于 2016-9-30 15:35:21 | 显示全部楼层 |阅读模式
请教各位大神几个问题。(1)PKH26和PKH67标记有什么区别?是不是都可以用来标记外泌体?   (2)我看PKH67标记步骤里面有一个BSA 终止染色,这个BSA和配抗体稀释液以及免疫荧光BSA封闭液的BSA相同吗?     (3)PKH67标记步骤中,标记后为什么还要重提外泌体呢?谢谢!       另附一张PKH67标记步骤,大家帮我看看有没有问题,三克油!

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发表于 2016-10-5 19:46:53 | 显示全部楼层

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1、颜色的区别,一个红色,一个绿色,看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的,但浓度不一样~
3、标记后重提,是因为你你的外泌体被稀释在了“标记液”中,如果你后面做摄取试验,这些标记液被你加到培养基里,不合适吧?

这个步骤没问题。
根据我做了很多次的经验,Diluent C可以少加一些,0.3-0.5ml足以(如果你是土豪,当我没说),相应的,你的PBS-EXO最好能控制在100ul左右。个人经验,供参考~
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 楼主| 发表于 2016-10-6 09:27:04 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2016-10-5 19:46
1、颜色的区别,一个红色,一个绿色,看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的,但浓度不一样~
3、标记后重提, ...

谢谢惜名兄!解答得很详细
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发表于 2016-10-9 10:37:04 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2016-10-5 19:46
1、颜色的区别,一个红色,一个绿色,看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的,但浓度不一样~
3、标记后重提, ...

想向大神问一下,这个红色和绿色是一定要在流式里面才能看到的吗,肉眼可见吗?谢谢
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发表于 2016-10-13 18:32:32 | 显示全部楼层
微泡biomarker 发表于 2016-10-9 10:37
想向大神问一下,这个红色和绿色是一定要在流式里面才能看到的吗,肉眼可见吗?谢谢 ...

PKH26/67原液,肉眼是能看到颜色的,分别是绿色和红色(在荧光显微镜下则分别是红色和绿色)。你染完exo,提纯后,再重悬,是看不到颜色的,因为量太少了。如果能看到,说明你肯定有了PHK原液的较多残留。PKH流式也可以做,但貌似比较麻烦一点,最常规的是做荧光显微镜或共聚焦。
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 楼主| 发表于 2016-10-17 09:54:47 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2016-10-5 19:46
1、颜色的区别,一个红色,一个绿色,看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的,但浓度不一样~
3、标记后重提, ...

请教惜名兄,我用的SBI试剂盒提取外泌体,提取出来后,如果做电镜,需要用多少体积PBS溶解外泌体?另外,如果提取RNA是不是直接加trizol,如果提取蛋白质就直接加蛋白裂解液?谢谢
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发表于 2016-10-18 17:24:49 | 显示全部楼层
yuantingdong 发表于 2016-10-17 09:54
请教惜名兄,我用的SBI试剂盒提取外泌体,提取出来后,如果做电镜,需要用多少体积PBS溶解外泌体?另外, ...

1、加多少PBS,你自己要摸索的;2、是的,直接加trizol或ripa
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 楼主| 发表于 2016-10-19 08:34:59 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2016-10-18 17:24
1、加多少PBS,你自己要摸索的;2、是的,直接加trizol或ripa

好的,谢谢惜名兄!还请教你一下,外泌体抽提后做WB,但不是立马做,是用PBS溶解放-80°C保存吗?如果这样,在提取蛋白之前用多大离心力可以把外泌体从PBS中分离沉淀出来?谢谢!
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发表于 2016-10-21 17:20:02 | 显示全部楼层
yuantingdong 发表于 2016-10-19 08:34
好的,谢谢惜名兄!还请教你一下,外泌体抽提后做WB,但不是立马做,是用PBS溶解放-80°C保存吗?如果这 ...

如果你再次从PBS里分离exo,就要再次超离了。。。所以,你可以把沉淀直接保存在-80度,不要重悬。或者重悬以后,直接加buffer煮沸跑WB,不用提纯、裂解了。用PBS的exo直接跑exo也是可以的
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 楼主| 发表于 2016-10-21 20:42:27 | 显示全部楼层
惜名 发表于 2016-10-21 17:20
如果你再次从PBS里分离exo,就要再次超离了。。。所以,你可以把沉淀直接保存在-80度,不要重悬。或者重 ...

谢谢惜名兄,I see
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