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【新手福利】MISEV2018解读(四)

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发表于 2019-3-11 10:21:47 | 显示全部楼层 |阅读模式
本周的周总结会在周日准时发送给大家。journal of extracellular vesicle发布新版本的《指导要求》,也就是《MISEV 2018》。这一版的内容要相对2014年的更多更复杂。Hzangs会隔三差五的解读一些重要内容。希望对大家有所帮助。 今天给大家推送第四期。本期内容有大量的示例和引文,但是hzangs认为最后一个示例用来分析特定组分是在细胞外囊泡的腔内还是膜上还是膜外结合是最有用的。大家可以关注一下。
以下内容均来自《MISEV 2018》,hzangs的评论会特别注明。

如何评估EV制剂中特定蛋白的存在
可以使用几种方法来量化EV中或表面的蛋白。蛋白质印迹(也就是WB,hzangs注)是最常用的,它应该通过以相等蛋白质总量或相等的特定参照蛋白的量将EV样品和相对应的母细胞裂解后的蛋白提取物并排进行实验,以确定分析的蛋白质是否在EV中显著富集(即使用等量的囊泡蛋白和细胞总蛋白进行WB并检测目标蛋白的丰度,看看目标蛋白是不是在细胞外囊泡中更多。或者使用特定的参照蛋白,在参照蛋白丰度一致的情况下看细胞外囊泡中蛋白的富集。Hznags注)。然而,这种仅可以比较容易地仅用于分析来自细胞培养条件培养基的EV;对于生物流体来说很难实现(其中EV可能来自流体中的细胞,但也来自流体接触管道的细胞,以及其他类型的分泌细胞,因此难以将EV归因于任何给定的细胞类型)(也就是说,体液里的定量,你们自己看着办,MISEV2018也不知道咋办。Hzangs注)。另外,可以使用微珠捕获EV用于流式细胞术分析或大量EV群体直接进行流式细胞术分析,检测其EV携带的特定蛋白,但要小心且严格设置对应的阴性对照(单独的抗体,同种型对照等)[48,220]。目前研究者已经开发了许多方法来同时分析EV上预先指定的一组表面蛋白标记物的存在。例如,在37个包被有不同抗体的微珠阵列上捕获外泌体后使用流式细胞仪进行分析[100,194]。其他方法包括使用荧光扫描[221]或表面等离子共振[222,223]来量化EV与包被不同抗体的表面的结合情况。这些方法是群体水平而非单EV水平的分析技术。质谱分析已经变得越来越经济,并且许多实验室可以实现对蛋白质的质谱分析,允许同时对许多蛋白质进行图谱分析。有关目前可用的EV分析方法的详尽综述,请参阅[224]。毫无疑问,很多新技术和设备将在短期内实现商业化应用。这些装置具有基于分泌的EV的数量和类型用于诊断目的的潜力,但是这些装置相关的挑战之一是它们是否可以得到足够量的EV用于后续的组学分析。(说半天,最后总结一下就4点:1、WB可以用,2、流式可以用,3、质谱可以用,4、如果你有技术,其他靠谱的方法也可以。 Hzangs注)

非蛋白质成分作为EV的标志物。
目前EV标志物相关的文献中主要强调了蛋白质。尽管是非特异性的,其他颗粒(脂蛋白)也可能含脂质,但是脂质双分子层中存在的特定种类磷脂也是EV存在的潜在阳性对照[225,226]。例如,虽然可能并不是所有EV上都存在,但磷脂酰丝氨酸(PS)可通过结合荧光标记的PS结合蛋白如AnnexinV [139,167]或lactadherin / MFGE8的C1C2结构域[ 186227]进行检测,间接证明EV的存在。鞘糖脂GM1神经节苷脂的结合也与上述情况类似[139,228](这里主要举了几个例子,并不是说它们可以作为阳性标志物。Hzangs注)。其他包括胆固醇,鞘磷脂,神经酰胺和磷脂酰胆碱/乙醇胺/肌醇等都可以可通过多种方法检测[225]。然而,胆固醇,鞘磷脂,神经酰胺和磷脂酰胆碱/乙醇胺/肌醇在EV中的比例与脂蛋白中发现的比例有何不同等研究数据还不完善:分离的EV和脂蛋白以及其他脂质成分的比较脂质组学研究可能对我们认识EV脂质组成的特殊性具有积极意义。另外,由细胞内组分活化的染料可用于标记EV。钙黄绿素和CFSE是细胞渗透性的非荧光原色染料,其被胞质内酶切割,产生无法透过脂双层膜的荧光分子;因此这些染料理论上可以标记完整的EV,并别可以与非闭合性的膜片段区分开来,条件是EV中存在所需的酶[230,231](这里提出了一种特异性高,同时操作上比标记CD63更为方便的EV标记方法,感兴趣的可以找参考文献看看。Hzangs注)。其他工具,如最近报道的蛋白质和脂质结合染料,di-8-ANEPPS [231],可能值得研究者进一步评估其灵敏度和特异性。此外,在所有研究中都需要适当的阴性对照,例如仅染料和染料加EV耗尽的基质(还是对照问题。使用亲脂染料的朋友们一定一定要注意这个问题!hzangs注)。关于核酸,已在EV中检测到DNA和RNA。尽管一些染料也可以检测非EV相关的RNA ,但EV制剂中的RNA可以尝试通过染料检测[232]。一些核酸种类可能可以作为某些EV的阴性或阳性标记。例如,严格的核RNA可能在未来被鉴定为阴性标记,而仅与细胞质复合物(例如核糖体RNA或线粒体DNA)相关的RNA [233,234]更可能存在于某些特定EV中。目前已经有报道在EV中发现了几种核RNA,并且已经有报道介绍了RNA特异性与非特异性结合到EV或EV的亚型中的各种数据[56,217,235-241]。因此,在使用核酸作为EV或EV亚型的特异性标志物的具体建议之前,需要更多的研究。(这段就是说,特定的脂质未来可能成为细胞外囊泡的阳性标志物,但是目前不行。亲脂性染料标记要做严格对照。hzangs注)

单囊泡分析
定量和全局蛋白质组成分析适用于大量EV的相关研究。然而,我们同样需要进行单个EV的相关研究。两种不同的研究策略提供不同方面的信息:通过抗体检测EV的特定组分,利用高分辨率技术观察单个EV时可以得到关于EV的结构和组成相关信息。然而,由于需要通过分析足够数量的EV以达到统计学上的置信度,它们可能难以以定量方式对单个EV进行分析。

直径大于光的衍射极限(~200nm)的EV可以通过常规荧光显微镜和常规流式细胞术进行可视化的单个EV分析。对于小于此极限的EV,共聚焦显微镜可以检测到荧光点,但是由于这些点既可以对应于直径小于200 nm的非常明亮的囊泡[242],也可以对应于小的暗淡多个囊泡组成的簇,而目前我们没办法区分两者[243]。

所有的EV都可以通过以下方法进行分析:电子显微镜或其他成像技术:SEM [244],TEM(通过对比和嵌入铀酰化合物和甲基纤维素的混合物来维持双层的形态。)cryo-EM[174,245,246];扫描探针显微镜(SPM),包括原子力显微镜(AFM)[247];和超分辨率显微镜[248,249]。注意,这些各种技术在一些情况下并不是等价的,并非所有的情况下这些技术都可以提供足够质量的图像。例如,cryo-EM清楚地显示脂质双层,相比使用TEM样品脱水条件下的检测,cryo-EM更好地保留了EV尺寸。因为给定体积中的所有颗粒都可以成像,而不仅仅是那些粘附的到一个表面(网格)的囊泡,因此cryo-EM可能能够更准确的定量。

不提供高分辨率图像但计算单个EV的生物物理参数的单粒子分析技术可用于量化大量的EV,这些研究手段比许多单EV技术具有更高的统计准确性。例如,尺寸可以通过纳米粒子跟踪分析从粒子位移模式推断[184,185,250];通过高分辨率流式细胞仪中的光散射和/或荧光检测[251-255];通过多角度光散射结合非对称流场分流(AF4-MALS)[256];通过基于可调电阻脉冲传感的装置中的电场位移;或通过荧光相关光谱分析(FCS)[257-259]。化学成分可以通过拉曼镊子显微镜评估[251-253]。

其他最近开发的技术旨在将成像的优势与大量EV的分析相结合。然而,它们目前在EV领域中不太常用,并且需要在多个实验室中进一步验证其有效性。例如,可以使用成像流式细胞仪捕获通过流体通道的单个细胞的图像,通过精心设计的一组控制和设置,在用荧光脂质,蛋白质或抗体标记后对所有大小的EV进行成像[260,261] 。最近设计的另一种装置包括在链霉亲和素蛋白包被的表面上捕获生物素化的EV,然后用荧光抗体连续几轮染色,成像和猝灭,对EV的组分进行分析[262]。另一个例子使用单粒子干涉反射成像感知在抗体涂层芯片上捕获的EV[263,264]。我们建议无论使用何种技术,都必须报告所有实验的细节。包括仪器和软件的品牌和版本,用于采集的设置(稀释缓冲液,相机,流速,阈值......),以及用于分析,EM或荧光显微镜的精确过程以及如何选择成像区域,以及相关的控制和校准信息。对于流式细胞仪,ISTH工作组最近发布了建议[265]。鉴于可用的技术和平台种类繁多,其中许多仍在开发中,MISEV2018尚无法提供精确的建议。(说了这么多,句话概括一下,1、单个EV的检测请用电镜等相关技术,2、检测单一EV并反映EV群体的特征,请使用NTA等手段,3、不管你用什么方法,请详细描述你的实验步骤和参数。Hzangs注)。

新建议:确定EV相关成分的拓扑结构
各种EV相关组分(包括核酸,蛋白质,聚糖等)的管腔与表面拓扑结构并不完全严格确定的。理论上,定位于释放EV的细胞胞质溶胶中的成分应位于EV内部,因此可防止蛋白酶或核酸酶轻度降解。虽然通常观察到这种保护作用,但一些研究意外地在EV表面发现了这些蛋白质[266],RNA[267]和DNA [41]的存在。并且发现它们对酶解消化敏感。尚不清楚这种拓扑结构是来自死亡或垂死细胞的碎片,还是由于在一些生理或病理条件下可能发生的细胞内隔室跨膜传输的尚未知晓的机制。当然,即使是细胞内物质的小程度污染(与EV的反向拓扑结构)也会使解释复杂化。拓扑对于功能也很重要。管腔活性成分需要膜融合或两个膜转运事件以在受体细胞中实现功能,而如果它暴露在EV的表面,它可能不依赖于EV与靶细胞的膜融合即可影响靶细胞的功能。因此,我们建议通过进行温和消化,透化或抗体研究来确定推定的活性成分的实际拓扑结构。(所谓的拓扑结构,就是你关注的分子与囊泡的关系。是在囊泡内部还是在囊泡表面,是插入膜内,还是与膜上蛋白相互结合。Hzangs注)。

这里提供一个用于评估特定EV成分拓扑结构的生化方法示例(参见[266,270]中的使用):对于给定的EV,准备四个样品:(1)等分试样1未经处理; (2)仅用单独的降解酶处理等分试样2,该降解酶应仅降解表面暴露的组分(例如蛋白质); (3)用酶和去污剂(如Triton X-100)处理等分试样3,这将确保表面和内部组分的降解(以证实酶处理有效)。注意,洗涤剂也可以增强某些分子的酶消化,而不依赖于膜的透化作用;洗涤剂的替代物是皂苷,其使膜透化。)(4)等分试样4仅用洗涤剂处理,以确保洗涤剂不影响下游分析。对于每个样品,通过适当的方法(SDS-PAGE,RT-PCR,PCR ......)分析感兴趣的成分(在小心地中和酶之后)。酶处理的,未经洗涤剂处理的等分试样中的信号消失表明关注的成分暴露于EV表面。对于RNA和DNA分析,RNA酶或DNA酶必须与蛋白酶一起使用,以允许核酸酶进入蛋白质保护的核酸。或者,可以使用流式细胞术和荧光显微术确定拓扑结构,其中抗体针对EV膜上的外部或细胞质表位。通过EM或AFM结合免疫标记进行单囊泡表征不仅可以提供表面可及目标或内部目标的验证(具有透化性),还有助于区分不同大小的EV之间的拓扑差异[247]。

好啦,今天这一次的解读就先到这里。今天介绍的内容其实对于大家进行细胞外囊泡的前期鉴定以及自己所感兴趣的组分的细胞外囊泡亚定位鉴定具有很好的指导意义,建议大家好好研读学习一下。最后给出了一个细胞外囊泡特定组分的亚定位分析方法,这个案例非常的详细,尤其是对于研究细胞外囊泡相关蛋白的朋友可以考虑借鉴学习一下。大家take it easy,还是以前那句话,根据自己准备投稿的水平来选择合适的方法完成自己的课题就好。注意在自己论文写作的时候避开一些容易被审稿人质疑的点。

O(* ̄— ̄*)o 让我们沐浴春风,收获paper~ 大家加油~

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