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PEG聚沉+超速离心 试用报告 :Sci Rep文章技术重复

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发表于 2016-4-26 11:48:14 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 hzangs 于 2017-8-17 11:06 编辑

文章及数据归属本人所有,未经本人书面许可,禁止转载,禁止使用本文数据。如有盗用,本人保留法律追究盗用者责任的权利。

文章进展介绍帖:http://www.exosome.com.cn/forum. ... amp;_dsign=3be6f05a
之前在论坛里跟大家分享了【Sci Rep】上一篇关于使用PEG聚沉+超速离心清洗 的方法分离外泌体的protocol。近几天后台一直有朋友反映说无法重复paper里的数据。在此我将自己试用的数据分享给大家,希望能对大家有所帮助。还请大家尊重我的劳动成果,未经我的许可,请勿使用相关数据及图片。


首先分享我的protocol 给大家:


细胞使用含有10% exosome-free FBS培液培养48小时收培液。


1、蒸馏水121℃灭菌20min,冷却待用。


2、8g PEG6000 +2.922g氯化钠 溶于水中,定容至50mL。


3、0.45um 滤器,过滤除菌待用。


4、培液离心2000g 10min,10000g 30min 除去细胞碎片,上清转移至新管子。


5、培液加入等体积PEG溶液。4°过夜。


6、10000g 离心1h,收的沉淀。


7、沉淀重悬于PBS(极易溶解于PBS),超速离心110000g 70min 收的沉淀。


8、WB 鉴定。




图1:步骤6 沉淀

图2:丽春红染色
图3:WB 检测CD63和ALIX

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 楼主| 发表于 2016-4-26 21:19:35 | 显示全部楼层
wjy 发表于 2016-4-26 20:26
请问一下你的cell1和cell2超速离心是我们正常超速离心的方法分离exosome,就是上清去杂质之后,直接100,000 ...

是的。  cell1 超离分离的时候出了点问题,没有收到……

ALIX是CST的  CD63 来自proteintech.
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 楼主| 发表于 2016-4-27 16:54:17 | 显示全部楼层
本帖最后由 hzangs 于 2016-5-18 14:10 编辑
pengqiao0605 发表于 2016-4-27 16:10
哇塞,你用的这细胞可真够给力的。我用的是T淋巴细胞系100ml上清也就做了个电镜。 ...

你用 巨噬细胞  或者 胰腺癌细胞 就知道了   那产量,简直是细胞把自己粉碎了 然后往外吐 exosome啊!
可能分泌旺盛的细胞  外泌体释放量会比较高。
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 楼主| 发表于 2016-5-4 14:52:10 | 显示全部楼层
yayinano 发表于 2016-5-4 13:48
群主,你好,最近使用了你给出来的protocol,我用的是病人抽出来的血清(本人医生),1ml血清,加了1ml的PE ...

你还是需要参考一下原文的。  只是我根据之前的一篇文献提供的方法做的。  你要读一下原文  看看他们是怎么做的。  我发这个帖子  主要目的就是验证一下他们方法的可行性,没有再做更多的尝试。
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 楼主| 发表于 2016-4-26 14:25:51 | 显示全部楼层
sakura_lan 发表于 2016-4-26 14:18
请问用了多少血清?电镜有做吗?

这是用的细胞上清液。 没有拍电镜
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 楼主| 发表于 2016-4-26 14:29:56 | 显示全部楼层
sakura_lan 发表于 2016-4-26 14:27
请问用了多少血清?

10%的FBS  培液
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发表于 2016-4-26 20:26:42 | 显示全部楼层
请问一下你的cell1和cell2超速离心是我们正常超速离心的方法分离exosome,就是上清去杂质之后,直接100,000g超速离心两次的样品吗?还有一个想向你咨询一下,你的CD63和ALIX的抗体是哪家公司的呀?货号多少可以告诉我吗?最近想买抗体,所有想咨询一下你的抗体公司,谢谢
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发表于 2016-4-26 20:39:14 | 显示全部楼层
还有一个小小的问题请教,PEG和细胞上清液的样品过夜的时候,有没有搅拌过夜那?还是就混匀后静静的放在4℃冷库那?
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 楼主| 发表于 2016-4-26 21:20:08 | 显示全部楼层
wjy 发表于 2016-4-26 20:39
还有一个小小的问题请教,PEG和细胞上清液的样品过夜的时候,有没有搅拌过夜那?还是就混匀后静静的放在4℃ ...

混匀 然后静静的放着,静静会帮你的
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发表于 2016-4-26 22:57:29 来自手机 | 显示全部楼层
hzangs 发表于 2016-4-26 21:20
混匀 然后静静的放着,静静会帮你的

哈哈哈谢谢解答
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发表于 2016-4-26 23:00:49 来自手机 | 显示全部楼层
hzangs 发表于 2016-4-26 21:19
是的。  cell1 超离分离的时候出了点问题,没有收到……

ALIX是CST的  CD63 来自proteintech.  ...

可以不可告诉我具体货号那?感觉你的wb图做的棒棒哒哈。想买你的抗体试一试哈~你用过TSG101和CD9的抗体吗?都用哪家公司的那?效果怎么样那?
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发表于 2016-4-26 23:00:59 | 显示全部楼层
你好,你的第一次离心就用的10000g, 有没有试过文献里的3000g呢? 谢谢。 我们实验室的离心机达不到10000g, 要超离, 但是超离的管子形状又很纠结,很难收集沉淀。
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