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外泌体提取蛋白做western检测标记物

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发表于 2016-6-22 20:28:25 | 显示全部楼层 |阅读模式
  各位同行,在采用超速离心发提取外泌体后,提取蛋白,western测CD63和CD9,最后结果没有跑出条带,考虑是不是浓度太低的缘故,可看文献中报道的结果都很好。请问各位有没有遇到这种情况,是如何解决的。非常感谢!

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发表于 2016-6-24 17:24:42 | 显示全部楼层
超离得到exosome pellet可用裂解液或直接loading buffer煮了跑WB
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发表于 2017-5-19 19:01:49 | 显示全部楼层
Johnny 发表于 2016-6-24 17:24
超离得到exosome pellet可用裂解液或直接loading buffer煮了跑WB

你好,想请问一个问题,我看到网站里有人说要用非还原性的loading buffer,那配裂解液的时后是不是不加DTT就可以了
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 楼主| 发表于 2016-6-25 09:24:34 来自手机 | 显示全部楼层
谢谢解答!
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 楼主| 发表于 2016-6-25 09:27:18 来自手机 | 显示全部楼层
Johnny 发表于 2016-6-24 17:24
超离得到exosome pellet可用裂解液或直接loading buffer煮了跑WB

请问一般加多少裂解液或者loading buffer?
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发表于 2016-6-26 12:08:26 | 显示全部楼层
这 看你外泌体量多少啊   少加点儿  100微升试试呗
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发表于 2017-5-30 16:55:05 | 显示全部楼层
Johnny 发表于 2016-6-26 12:08
这 看你外泌体量多少啊   少加点儿  100微升试试呗

你好,我想求助!关于exosome蛋白的western blot,我做的是CD63的鉴定,用的是Qiagen厂家的exoEasy Maxi kit试剂盒提取的细胞上清15ml的外泌体(共6个不同时间点的样本),最后溶于500ul XE buffer。前后一共做了6次WB,起初是没有用裂解液,配的10%胶,直接取20ul加相应的loading buffer,100度变性后上样,然后出来的条带是连续一条直线,之后改了各种试剂及条件,仍是一条线,我怕是自己的技术问题,同时期同条件下还跑了以前剩余的普通蛋白标本,杂的是GAPDH,跑出来的泳道间隔都没问题,证实我的技术还行。于是在最后一次加了裂解液(MPER+PMSF)后,显影竟然是白板,Oh MY GOD,我想死的心都有了。也翻阅了好多文献,但是都不是说的很具体详细
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发表于 2017-6-2 20:13:26 | 显示全部楼层
不是说并非所有的外泌体都高表达CD9,CD63,CD81,只要其中一个或两个高表达就好了吗?我做的细胞,它的外泌体也就只有CD9高表达,CD81和TSG101表达量跟细胞裂解液差不多,而且没有beta-actin,GAPDH和HSP90.应该是不一样的外泌体不一样的marker。
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发表于 2017-6-7 21:43:34 | 显示全部楼层
Johnny 发表于 2016-6-24 17:24
超离得到exosome pellet可用裂解液或直接loading buffer煮了跑WB

为什么不能用PBS重悬呢?
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发表于 2017-6-8 10:16:41 | 显示全部楼层
meiling 发表于 2017-6-7 21:43
为什么不能用PBS重悬呢?

同问,我用的试剂盒要用PBS重悬
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