本帖最后由 hzangs 于 2016-1-5 16:01 编辑
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Nature protocol: 胞外囊泡功能研究中的新示踪系统
胞外囊泡在细胞间传递作为一种细胞间交流、传递大量的生物功能分子的重要方式日益受到重视。通过对in vitro或者 ex vivo的方式分离纯化出的胞外囊泡在生物功能方面的作用研究逐渐深入，胞外囊泡的作用也逐渐被重视起来。虽然可以在体外通过亲脂染料标记保外囊泡再回输到体内，进行囊泡的示踪。但是，在体内条件下研究体内细胞分泌的胞外囊泡的摄取还面临着很大的挑战，这主要是因为目前的技术没有办法研究內源分泌的特定胞外囊泡在体内的行为，无法在体内区分摄取过特定胞外囊泡（內源产生，非体外输入）和没有摄取过特定囊泡的细胞。最近，Carrie Maynard & Jacco van Rheenen等研究者在Cre-loxP系统上进行技术研发，以荧光标记的携带Cre重组酶位点的报告细胞摄取表达Cre重组酶细胞分泌的胞外囊泡为模型，来解决一系列体内体外实验问题。 该文章描述了用于产生酶Cre的细胞和报道细胞的方法，该系统的建立约需要6周；同时描述了用该系统在体外或体内（小鼠模型上）进行设置和实验的方法，整体实验时间仅需要约2个月。
让我们来粗略了解一下这篇方法学的论文： Figure1：作者介绍了通过Cre-loxP系统追踪胞外囊泡摄取的理论方法。A. Cre-loxP系统作为报告两种实验确定的细胞类型之间的EV交换方法的模式图。（表达Cre重组酶的细胞分泌的EV会携带Cre mRNA，报告细胞则标记了两种荧光基因，在没有摄取前者分泌的EV时，表达红色荧光蛋白，摄取后 Cre mRNA表达出 Cre酶切割loxP，使红色荧光编码基因被切除，绿色荧光显现。）（B，C）共培养法和细胞间无接触的Transwell实验装置的模式图。（D，E）研究同一肿瘤中肿瘤细胞之间的体内EV交流和远距离肿瘤细胞之间的体内EV交流模式图。
Figure2： 作者展示了Cre重组酶细胞和Cre报告细胞的构建方法。通过病毒转染和药物筛选得到相对应的稳转细胞系。
Figure3：作者在这个图中展示了体外追踪EV的摄取和计算摄取效率的方法。A.可以看到在浅蓝色的表达Cre重组酶细胞存在时，共培养可看到有细胞摄取EV 而被改变成绿色。B.transwell实验验证，这种改变不需要细胞间的接触。C.统计计算摄取效率的方法：表现为GFP的细胞占GFP和红色荧光细胞的比例。
Figure4:作者在这个图中 展示了该系统在体内的工作效果。即 将两种细胞打到小鼠体内并进行与figure3相同的分析。 可以看到效果还是很不错的。
该系统曾被用来证明胞外囊泡在体内传播的广泛性。详情请见外泌体之家相关帖“Cell：体内成像证实胞外膜泡（extracellular vesicle）体内传递广泛性”
相比之前大家常用的亲脂染料标记，这个是用Cre-loxP的系统在操作上相对复杂，但是该系统可以解决亲脂染料对实验的影响，尤其是体内实验亲脂染料定位的假阳性问题。而且该系统可以做到一劳永逸，只要标记了EV的供体细胞和受体细胞即可一直用来试验，不必每次都进行染色，而且还可以在体外、体内追踪EV的作用效果。在小编看来，该系统的难点就在于需要构建Cre重组酶和loxP-DsR-loxP-GFP系统的转染病毒。但是相信由于目前各大商家对胞外囊泡、外泌体领域的关注，很快会有相关商家推出商品化的质粒和转染病毒。大家就拭目以待吧。
论文： Nature protocol：Studying extracellularvesicle transfer by a Cre-loxP method
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发表于 2016-1-5 15:45:11
收藏
发表于 2016-1-5 22:02:53
楼主
那篇paper的结论上就可以了。 
发表于 2016-1-6 08:31:14
楼主好人
