PKH26和PKH67标记

yuantingdong

请教各位大神几个问题。（1）PKH26和PKH67标记有什么区别？是不是都可以用来标记外泌体？   （2）我看PKH67标记步骤里面有一个BSA 终止染色，这个BSA和配抗体稀释液以及免疫荧光BSA封闭液的BSA相同吗？     （3）PKH67标记步骤中，标记后为什么还要重提外泌体呢？谢谢！       另附一张PKH67标记步骤，大家帮我看看有没有问题，三克油！

惜名

1、颜色的区别，一个红色，一个绿色，看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的，但浓度不一样~
3、标记后重提，是因为你你的外泌体被稀释在了“标记液”中，如果你后面做摄取试验，这些标记液被你加到培养基里，不合适吧？

这个步骤没问题。
根据我做了很多次的经验，Diluent C可以少加一些，0.3-0.5ml足以（如果你是土豪，当我没说），相应的，你的PBS-EXO最好能控制在100ul左右。个人经验，供参考~

yuantingdong

惜名 发表于 2016-10-5 19:46
1、颜色的区别，一个红色，一个绿色，看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的，但浓度不一样~
3、标记后重提， ...

谢谢惜名兄！解答得很详细

微泡biomarker

惜名 发表于 2016-10-5 19:46
1、颜色的区别，一个红色，一个绿色，看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的，但浓度不一样~
3、标记后重提， ...

想向大神问一下，这个红色和绿色是一定要在流式里面才能看到的吗，肉眼可见吗？谢谢

惜名

微泡biomarker 发表于 2016-10-9 10:37
想向大神问一下，这个红色和绿色是一定要在流式里面才能看到的吗，肉眼可见吗？谢谢 ...

PKH26/67原液，肉眼是能看到颜色的，分别是绿色和红色（在荧光显微镜下则分别是红色和绿色）。你染完exo，提纯后，再重悬，是看不到颜色的，因为量太少了。如果能看到，说明你肯定有了PHK原液的较多残留。PKH流式也可以做，但貌似比较麻烦一点，最常规的是做荧光显微镜或共聚焦。

yuantingdong

惜名 发表于 2016-10-5 19:46
1、颜色的区别，一个红色，一个绿色，看你需要什么颜色。
2、BSA是相同的，但浓度不一样~
3、标记后重提， ...

请教惜名兄，我用的SBI试剂盒提取外泌体，提取出来后，如果做电镜，需要用多少体积PBS溶解外泌体？另外，如果提取RNA是不是直接加trizol，如果提取蛋白质就直接加蛋白裂解液？谢谢

惜名

yuantingdong 发表于 2016-10-17 09:54
请教惜名兄，我用的SBI试剂盒提取外泌体，提取出来后，如果做电镜，需要用多少体积PBS溶解外泌体？另外， ...

1、加多少PBS,你自己要摸索的；2、是的，直接加trizol或ripa

yuantingdong

惜名 发表于 2016-10-18 17:24
1、加多少PBS,你自己要摸索的；2、是的，直接加trizol或ripa

好的，谢谢惜名兄！还请教你一下，外泌体抽提后做WB，但不是立马做，是用PBS溶解放-80°C保存吗？如果这样，在提取蛋白之前用多大离心力可以把外泌体从PBS中分离沉淀出来？谢谢！

惜名

yuantingdong 发表于 2016-10-19 08:34
好的，谢谢惜名兄！还请教你一下，外泌体抽提后做WB，但不是立马做，是用PBS溶解放-80°C保存吗？如果这 ...

如果你再次从PBS里分离exo，就要再次超离了。。。所以，你可以把沉淀直接保存在-80度，不要重悬。或者重悬以后，直接加buffer煮沸跑WB，不用提纯、裂解了。用PBS的exo直接跑exo也是可以的

yuantingdong

惜名 发表于 2016-10-21 17:20
如果你再次从PBS里分离exo，就要再次超离了。。。所以，你可以把沉淀直接保存在-80度，不要重悬。或者重 ...

谢谢惜名兄，I see