外泌体RNA有核糖体RNA污染

531423028

提的细胞上清外泌体RNA一直有少部分rRNA(18s和28S)污染，求解？
细胞上清预处理

1.50ml细胞培养上清，300 x g，5min，将细胞与细胞碎片离心于管底。

2.将上步骤中的上清转移到新管中，1200 x g，20min去掉细胞碎片。

3.将上步骤中的上清转移到新管中，10000 x g，30min去掉大的EVs。

4.将上步骤中的上清进行超滤浓缩（100k的超滤管）。

用SBI试剂盒进行捕获，qiagen试剂盒抽提。

安捷伦2100 pico芯片结果：  

Fragment Table
Name	Start Time	End Time	Area	% of total Area
18S	37.38	41.52	11.1	0.9
28S	42.39	46.34	5.7	0.5
Overall Results:
RNA Area:	1260.691
RNA Concentration:	8444.751	pg/μl
rRNA Ratio [28s / 18s]:	0.511594
RNA Integrity Number (RIN):	2.6   (B.02.08)
Result Flagging Color:	16768991
Result Flagging Label:	RIN: 2.60

531423028

下里巴人 发表于 2017-6-16 10:23
请教楼主超滤管的型号和品牌？非常感谢！

超滤管事密里博得  15ML  100kda

想飞的伞

rRNA其实不少，而且大部分可能是片段化的，所以你除也除不干净，分析的时候这部分reads 不要了就行。

下里巴人

请教楼主超滤管的型号和品牌？非常感谢！

531423028

baishixiaoyaozi 发表于 2017-6-11 03:48
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24255815
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/j ...

好的，太感谢了！这个已经让我郁闷很久了，谢谢你！

baishixiaoyaozi

531423028 发表于 2017-6-10 16:17
版主，你说的“有理论认为外泌体中有少量的rRNA”这个有没有相关的文献支撑，可否发我看一下？谢谢了 ...

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24255815
http://journals.plos.org/plosone ... ournal.pone.0136133
随便搜了2篇

hzangs

531423028 发表于 2017-6-10 16:17
版主，你说的“有理论认为外泌体中有少量的rRNA”这个有没有相关的文献支撑，可否发我看一下？谢谢了 ...

一些测序结果里还是能看到有rRNA的，你可以搜索寻找一下。 同时一些测序公司的朋友也探讨过，他们确实测到的数据中也有rRNA。

531423028

hzangs 发表于 2017-6-9 16:10
有理论认为外泌体里会有少来个的rRNA。 你做二代测序的话  这个应该可以凑合用了。你这个量已经很小了吧 ...

版主，你说的“有理论认为外泌体中有少量的rRNA”这个有没有相关的文献支撑，可否发我看一下？谢谢了

531423028

baishixiaoyaozi 发表于 2017-6-9 21:45
我之前用质谱分析过原代胶质细胞来源的外泌体，检测到核糖体蛋白，所以不算污染，外泌体自身就携带核糖体。 ...

我是担心这是宿主细胞里面的核糖体，这样子的话肯定也会有宿主mRNA的污染。宿主的核糖体RNA可以去掉，但是mRNA去不掉，怕会影响测序结果。

531423028

hzangs 发表于 2017-6-9 16:10
有理论认为外泌体里会有少来个的rRNA。 你做二代测序的话  这个应该可以凑合用了。你这个量已经很小了吧 ...

是的，这个量却是很少，只占1％~2％，但是我想知道目前没有一个标准达到一个什么样的值对测序才不会有影响。我是担心这是宿主细胞里面的核糖体，这样子的话肯定也会有宿主mRNA的污染。宿主的核糖体RNA可以去掉，但是mRNA去不掉，怕会影响测序结果