外泌体的分离鉴定

jinzc0228

上周用分别用SBI的EXOquick-TC试剂盒和超速离心法提取了细胞培养上清的外泌体，都可见明显的有形沉淀，均用200μl重悬后冻存在-80度。
然后做了DLS分析，粒径在除了在100NM附近分布以外，也有很多大粒径颗粒存在。
问题来了：1.两种方法提取分离过程中均用0.22微米滤膜过滤，为什么最后都有大粒径的颗粒存在？是否外泌体没有分散好？
               2.用基于适配体和抗体捕获的多种方案检测外泌体，均无明显信号，是否可能外泌体在从-80度拿出后在室温下复溶时，外泌体都破坏掉了

baishixiaoyaozi

Kit没有用过，不发表意见。但超速离心后确实看见过大的particle (>200 nm)，有文献说超速离心会导致aggregates的形成。

我们实验室免疫亲和捕捉的方法，CD63抗体，人血清。WB检测到elute中很强的CD63信号。你用的抗体是否适用于IP？细胞培养基上清中exosome浓度是多少？这些因素都会影响抗体-抗原识别。

祝实验顺利。

jinzc0228

外泌体浓度没测，打算捕获实验有结果后再做定量，因为看到了有形沉淀，猜想浓度应该不低。外泌体来自于HepG2细胞，捕获用的适配体和抗体分别采用了cd63和epcam，均无明显信号，还没用WB验证

meiling

jinzc0228 发表于 2017-6-3 07:17
外泌体浓度没测，打算捕获实验有结果后再做定量，因为看到了有形沉淀，猜想浓度应该不低。外泌体来自于HepG ...

你用cd63能看到沉淀吗？用了多少毫升培养基？

jinzc0228

meiling 发表于 2017-6-3 16:27
你用cd63能看到沉淀吗？用了多少毫升培养基？

cd63抗体只是在分离外泌体后做捕获探针来验证外泌体的存在，SBI 试剂提取用了30ML,超离用了100ML培养基上清

xiu

同问，我在超高速离心的时候也出现了第一种情况

步步唧唧

问一下楼主关于CD63适配体识别，你是用的荧光竞争的吗？

八戒在五湖

baishixiaoyaozi 发表于 2017-6-3 01:14
Kit没有用过，不发表意见。但超速离心后确实看见过大的particle (>200 nm)，有文献说超速离心会导致aggrega ...

请问您有免疫亲和捕捉的protocol吗，老板让做，可我在这方面不太懂

baishixiaoyaozi

八戒在五湖 发表于 2017-6-19 20:50
请问您有免疫亲和捕捉的protocol吗，老板让做，可我在这方面不太懂

https://scholar.google.com/schol ... =&as_sdt=1%2C21