关于Exo的WB检测

luckkit · 发表于 2015-3-31 11:31:52

急问，做Exo的WB检测前，Exo沉淀到底是该有RIPA裂解还是直接用PBS重悬？以前制备的Exo都是用PBS重悬的，600ng/ul左右，如果再加RIPA，是否蛋白浓度太低，能否直接加loading buffer煮沸，再超声，就上样跑胶？谢谢！

songkai900818 · 发表于 2015-3-31 21:00:19

可以用PBS先洗一下，然后再加RIPA裂解，一般沉淀不会轻易被洗掉

luckkit · 发表于 2015-4-1 13:12:30

谢谢楼上诸位，直接加4x loading buffer 95度10min，冻回-80度，明天上样跑WB

luckkit · 发表于 2015-4-3 12:44:48

上样20ug,WB曝光，效果不理想，CD9,TSG101,GRP94, abcam兔源单抗，1/1000,二抗1/5000，其中TSG101（曝光120s）很弱，GRP94总蛋白（曝光120s）出现条带，但EXO也有弱带，难道标准差异超离所得产物不纯？而CD9完全无带，直接孵鼠源抗CD81过夜（未stripe），明天再看。

luckkit · 发表于 2015-4-3 12:47:33

如果效果还不理想，就准备最多上50ug,另外改用RIPA重悬pellet,提高抗体浓度，或改用胶片曝光，目前只能够想到这些，请大家多建议，谢谢

luckkit · 发表于 2015-4-3 21:59:32

Johnny 发表于 2015-4-3 03:34
你离心的步骤具体是怎么样的？

CD9没有条带应该是正常的，感觉不是所有的细胞分泌的exosome都有CD9。

按照wiley protocol来的，CD9关键是提取的细胞总蛋白也没有曝光出来。
谢谢！

fengshilou · 发表于 2015-4-21 20:44:10

我们的也没有出来

kuguaquhuo · 发表于 2015-5-7 22:01:39

luckkit 发表于 2015-4-3 12:44
上样20ug,WB曝光，效果不理想，CD9,TSG101,GRP94, abcam兔源单抗，1/1000,二抗1/5000，其中TSG101（曝光120 ...

弱弱问下，你提EXO做WB，统一上样量后，岂不是所含exo量相同，那exo上的标志蛋白的量不就也相同了，刚接触，求解答，我想做WB表明exo的量。

luckkit · 发表于 2015-5-8 03:53:08

本帖最后由 luckkit 于 2015-5-7 13:56 编辑

不同组织或细胞来源的Exo其标志蛋白含量不尽相同,WB似乎不能用于Exo定量，用NTA系统吧

yy8651 · 发表于 2015-5-8 09:14:24

WB的意义是什么呢？

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