请教采用差速超速离心法提取血清外泌体的方法

关节科小大夫

我尝试用以下方法提取外泌体
血清+PBS→4℃ 300g 离心15分钟→取上清液，4℃ 2,000g 离心30分钟→取上清液，4℃ 10,000g离心30分钟→过0.22um滤器→4℃ 10,000g离心30分钟→取上清液，4℃ 110,000g离心70分钟→弃上清，留下的沉淀加PBS→4℃ 110,000g离心70分钟→弃上清，沉淀50ulPBS重悬。
我做了TEM，结果不理想，没有看到明显的囊泡，但是WB显示有条带。
感觉还是分离方法有点问题，请教各位老师：
①分离方法还需要有哪些改进，或者有没有更成熟的方法？我查阅了文献，方法不一，离心参数不一，有些迷茫。
②有无必要应用滤器？感觉如果用滤器的话，会丢失很多囊泡。
③在第一次110,000离心70分钟后，管壁上看到了有点透明的白色的膜状沉淀，这是不是就是外泌体沉淀？但是用PBS重悬的时候非常困难。
④请教最后的沉淀用PBS重悬的时候有没有技巧？
谢谢各位，初入外泌体领域，多多指教。

zhan

滤器是为了过滤细菌，个人觉得做TEM不要求无菌，没必要用滤器。

aa3716340

你好，你现在方法有优化吗，最近也在超离血清，但是分离出来BCA蛋白含量很高，能否分享一下最近分离心得

guojishen

我现在也在做血液细胞方面的超离，4℃ 2,000g 离心30分钟→取上清液，4℃ 10,000g离心30分钟，4℃ 100,000g离心70分钟→弃上清，留下的沉淀加PBS 1ml重悬，0.22um滤器过滤，4℃ 100,000g离心70分钟→弃上清，基本看不到沉淀，然后盲目用300ulPBS重悬，重悬有无什么技巧？

WinterBlinder

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