肿瘤液体活检技术：CTC和ctDNA孰优孰劣？

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来源：MedSci

如果医生想深入了解肿瘤，他们的选择很有限。他们可以扫描相关区域、采集组织活检，或监控血液的标志物，如PSA或CA 125。不过，这些都不太理想：成像的分辨率不高，活检是侵入性的，而良好的标志物是少之又少。

最理想的情况是，研究人员能通过简单的血液检测来实现组织活检的敏感性和特异性。如今，液体活检的出现，让这一切成为可能。

液体活检

据斯坦福大学医学院的助理教授Max Diehn介绍，就传统的癌症标志物而言，普遍的问题是特异性。“对于之前探索的大多数生物标志物，正常细胞也会产生，因此并不是肿瘤细胞所独有的。这意味着，它们往往不是很特异。”液体活检则通过搜索血液及其他体液中更加特异的肿瘤指纹，来克服这方面的缺陷。

这些指纹有两种形式：循环肿瘤细胞（CTC）是从肿瘤上脱落的活细胞，可能代表了转移的种子；循环肿瘤DNA（ctDNA）则是来自死细胞的遗传物质，通常以DNA短片段的形式存在。Diehn实验室最近介绍了一种检测非小细胞肺癌患者血液中的ctDNA的方法，这些片段的平均长度为170 bp 。

当然，正常细胞也存在于血液中，而且每天都有正常细胞死亡。因此，无论研究人员是寻找CTC还是ctDNA，他们都必须慧眼识珠。对于CTC，这通常是借助细胞表型来实现的，如利用Janssen Diagnostics的CELLSEARCH分析，它根据上皮细胞标志物的表达来选择细胞。

对于ctDNA，研究人员必须根据它们的序列来挑出片段，这是个艰巨的任务，因为没突变的DNA不能提供信息。因此，这项技术适用于突变已知的情况。例如，Diehn开始鉴定NSCLC患者中常常突变的基因组区域，生成CAPP-Seq selector文库。这个寡核苷酸集合代表了139个基因的521个外显子和13个内含子。研究小组利用它来收集血浆中的互补DNA片段，并以高覆盖度测序。

根据2014年约翰霍普金斯大学医学院的研究，ctDNA可在各类肿瘤患者的血浆或血清中发现，不过随着肿瘤位置和分期的不同，分析的敏感性也有差异。“75%的晚期胰腺癌、卵巢癌、大肠癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌等癌症患者中可检测到ctDNA，不过对于原发性脑癌、肾癌、前列腺癌或甲状腺癌，检测率不到50%，”作者写道。

约翰霍普金斯大学的肿瘤学教授Nickolas Papadopoulos表示，研究人员可以通过靠近源头来实现更高的敏感性，比如，在检查泌尿生殖系统肿瘤时检测尿液，或在检查头颈部癌症时检测唾液。实际上，研究小组最近发现通过脑脊液检查，使得中枢神经系统的肿瘤检测有所改善。

如同许多ctDNA研究一样，霍普金斯的团队也使用靶向测序来检测ctDNA。在这种情况下，一种称为Safe-SeqS的条形码策略可准确报告样本中的ctDNA分子数量。研究人员也可以利用数字PCR来定量具体的变化，不过有的作者指出，“数字PCR分析提供了高的准确性和灵敏度，但需要个性化分析的设计，这是限速步骤”。

有利有弊

研究人员检测癌症患者的血液及其他体液中的ctDNA，使其成为一种有潜力的生物标志物。然而，据Papadopoulos介绍，ctDNA不仅仅是指标，似乎还与“肿瘤负荷”有关，其水平随疾病严重程度而升高。此外，一些早期的癌症也能检测到ctDNA，表明不仅可使用ctDNA来监控现有的癌症，还能作为筛查工具。

美国国家癌症研究所淋巴治疗科的科长Wyndham Wilson表示，ctDNA还能用于预测肿瘤的复发。在一项弥漫性大B细胞淋巴瘤的研究中5，ctDNA能够在CT扫描前几个月就发现肿瘤复发。因此，医生能够更早治疗患者，改善他们的长期预后。

然而，ctDNA作为筛查工具，也面临一些潜在的问题。目前还不清楚ctDNA在不同的癌症类型、分期和患者中的普遍程度。即使检测到ctDNA，也不清楚是体内哪里产生的，或者即使检测到的突变与肿瘤存在一定关联，也需要后续检测。

相比之下，CTC分析能提供基因组完整的活细胞。因此，研究人员可分离出这些细胞，在显微镜下观察它们，并研究每个细胞的基因组和蛋白表达。Aviva Biosciences公司的研发副总裁Antonio Guia认为，这带来了比ctDNA分析更广谱的方法，因此你不必看特定基因的特定片段。

最近，哈佛大学的Daniel Haber及其同事就开展了一些研究，利用单细胞RNA-Seq来鉴定单个前列腺癌CTC的信号差异，并将这些差异与治疗反应相关联6。研究小组利用一种称为CTC-iChip的微流体设备来分离CTC，它根据CD45或CD66的表达将CTC与其他血细胞分离。

不过，对于液体活检而言，问题并不在于选择CTC还是ctDNA。Janssen Diagnostics的首席医疗官Jorge Villacian认为，两种标志物能提供互补的信息，作为临床工具都有市场。这家公司专注于CTC诊断。

“肿瘤医生以及监管部门对液体活检的概念了解得越多，对每个人都是双赢的 – 对患者、对医生以及对制度本身，因为这将使得发病率更低、并发症更少，并改变早期治疗，对患者有利。”

小知识：ctDNA是什么

癌细胞在破裂和死亡时，会释放出循环肿瘤DNA（ctDNA）等内容物，这种ctDNA是飘浮在血液中的基因组片段。细胞残骸一般由清道夫细胞（如巨噬细胞）清除，然而肿瘤很大细胞增殖又很快，导至清道夫细胞应付不过来。

对血液中的肿瘤DNA进行检测和测序，可以帮助人们通过取血得到更全面的癌症信息，告诉医生治疗是否已经起作用，肿瘤有没有演化出抗性。

当然这一技术的应用也面临着一些问题。举例来说，不同人的ctDNA水平差异较大，而且ctDNA并不那么容易检测，特别是在肿瘤的早期阶段。另外，人们还需要在更大型的研究中进行验证，看ctDNA是否给出了足够准确的信息。

如果能够克服上述障碍，医生们将能根据ctDNA进行更好的治疗，随着癌症的演化调整治疗策略，Johns Hopkins大学的Victor Velculescu说。“这种技术可以帮助人们最终实现个性化医疗，为癌症领域带来一场新的变革。”

ctDNA发展简史

1948年科学家们首次发现人体血液中存在着循环DNA，癌症患者的循环DNA则发现于1977年。在那之后又过了17年，人们才发现这些DNA含有癌症的标志性突变，说明它们来自于肿瘤。

最开始，循环DNA的实际应用并不在癌症领域。鉴于肿瘤DNA会流入血液，香港中文大学的卢煜明（Dennis Lo）教授推测胎儿DNA应该也能进入血液。1997年他向人们成功展示，孕妇血液中携带着男性胎儿的Y染色体。这一发现允许医生们在怀孕初期通过无创方式检测胎儿的性别，甚至筛查唐氏综合症等发育疾病。这是产前诊断领域的一次革命。

“癌症研究后来才跟上进度，”英国癌症研究所Nitzan Rosenfeld说。这是因为肿瘤DNA比胎儿DNA更难检测，而且早期的测序技术还不够准确可靠。

近十年来随着技术的进步，DNA检测技术已经足够灵敏。举例来说，BEAMing扩增法可将循环DNA连在磁珠上，然后进行分离和计数。即使健康细胞DNA与ctDNA的比值达到10,000：1，BEAMing扩增法也可以有效检测出ctDNA来。

BEAMing扩增法是JohnsHopkins大学的Bert Vogelstein和Kenneth Kinzler开发的。2007年，他们用这一技术对18名肠癌患者的ctDNA进行了跟踪。手术后这些患者的ctDNA水平下降了99%，其中许多患者的ctDNA并没有完全消失。研究显示，手术后仍检测得到ctDNA的患者，基本上都出现了癌症复发。但手术后没有检测到ctDNA的患者，肠癌并没有复发。

这说明ctDNA能够展现患者对手术的应答情况，告知医生他们是否需要进行化疗。研究者们很快也在其他癌症类型中得到了类似的结果。Rosenfel等人发现，ctDNA能够提供晚期卵巢癌和乳腺癌的准确信息。而Diaz等人在至少75%的晚期肿瘤患者中检测了ctDNA，涉及了多种器官，比如胰腺、膀胱、皮肤、胃、食道、肝脏和头颈。（脑癌除外，因为血脑屏障使肿瘤DNA无法进入血液。）

ctDNA有何优势

循环DNA将比人们几十年来鉴定的蛋白指标更加好用，因为ctDNA检测很少有假阳性。此外，ctDNA半衰期只有不到两小时，而绝大多数蛋白指标能在血液中存在几个星期，可见ctDNA能更清晰的反映肿瘤的当前信息。有研究表明，在检测乳腺癌和肠癌时，ctDNA比蛋白质指标更灵敏，还可以跟踪肿瘤的消失、扩散和复发。

血液中的循环肿瘤细胞也是癌症研究的一大热点。不过，ctDNA比循环肿瘤细胞还要灵敏，数量也更多，更适合成为癌症的生物学指标。

ctDNA的最大优势在于，能够对肿瘤的演化和适应性改变进行监控。这样的研究可以回答许多困扰科学家多年的问题，比如，为何那么多靶向性治疗都以失败告终，癌症是怎样发展出抗性的等等。

EGFR在细胞生长和分裂中起到了重要的作用，在癌细胞中特别活跃。Gefitinib和panitumumab是阻断EGFR的抗癌药物，这些药物起初都能有效治疗患者。但几个月后，癌症就会通过其他基因突变（例如KRAS）对它们产生抗性。

要监控患者的癌症发展，医生们目前得进行多次活检，以决定下一步的治疗策略。然而癌症晚期患者通常有好几个需要检测的肿瘤，单个肿瘤中也可能存在不同的抵抗机制。更重要的是，活检有一定的风险性，难以用于肺部等脆弱的器官。相比之下，血检就容易多了。

2012年，Diaz研究团队对接受EGFR抑制剂治疗的患者进行ctDNA分析。他们发现了42种与癌症抗性有关的KRAS突变，利用这些突变可以比传统方法早五个月发现肿瘤的变化。Rosenfeld团队则收集了六名晚期乳腺癌、肺癌和卵巢癌患者的血样，并且进行了完整的外显子组测序。他们由此揭示了癌症抗性的发展路径，例如癌细胞出现突变，阻止药物与其目标结合。

如果医生们能够及时发现癌症的抗性，就可以早点停用已经不起作用的昂贵药物。研究癌症抗性背后的突变，还有助于开发更有效的癌症疗法或者药物组合。“我们的目标是将癌症从一种致命疾病转变为一种慢性病，” Velculescu说。“当治疗不起作用时，可以换用其他的治疗途径。”

科学家们逐渐发现，肿瘤有着很高的异质性，标准程序（tissue biopsy）根本不足以判断癌症的预后情况。而且活检得到的是静态信息，无法准确反映癌症的演化。在这种情况下，ctDNA就成为了科学家们的新希望，它能为人们揭示更多的癌症信息，甚至跟踪癌症的发展。

如果能够得到充分利用，血液循环中的肿瘤DNA将为癌症治疗带来一场变革。

理想与现实

潜力巨大，但目前ctDNA还无法成为临床上的主要诊疗手段。这是因为，最灵敏的ctDNA检测（例如BEAMing）需要事先知道想要检测的突变，但获得这样的信息又相当麻烦。外显子组测序不需要预先知道任何信息，但检测罕见突变的需求深度测序，这样做的成本非常高。

斯坦福大学的MaximilianDiehn决定将上述两种方法的优点结合起来。他的研究团队发现，基因组有一小部分（仅0.004%）在肺癌中反复突变。在获得患者血样之后，对这一部分进行深度测序，能够以低廉的成本检测罕见突变。目前，该团队正在尝试将类似技术用于其他类型的癌症，并在临床试验中加以验证。

几乎所有的活检技术，都不能很好的检测早期癌症。ctDNA在一项研究中检测出了所有II级以上的肺癌，但只检测出了一半的I级肿瘤，这多半是因为晚期癌症能释放出更多的DNA。这个问题无意会限制ctDNA在癌症筛查中的应

用。

在ctDNA走入临床之前，还有一些其他的问题有待解决。例如，ctDNA是否能真实反映癌症的特征？转移瘤是否和原发瘤释放同样多的DNA？Diaz指出，人们需要在患者死后快速对所有肿瘤取样，将其与患者生前的ctDNA进行比较。“这将是一项艰巨任务，”他说。

ctDNA提供的信息是否真的能够挽救患者生命或者提高他们的生活质量呢？“光监控肿瘤是不够的，”Johns Hopkins大学的肿瘤学家Luis Diaz说。“实际应用才是我们面临的真正挑战。”

目前，癌症的靶向性治疗还远远跟不上科学家们的癌症研究。如何将研究成果转化为医疗进步，这也是ctDNA研究中最现实的一个问题。

ctDNA可能一时半会儿还无法决定癌症的治疗，不过它仍不失为一个宝贵的研究工具。越来越多的医生正在把ctDNA采集列入自己的常规操作中。

小知识：CTC

1.循环肿瘤分子特征分析

英国癌症中心发表在NatureReviews上的综述，全面的介绍了CTC经历EMT机制入血到形成转移灶的过程中CTC的分子特征的的变化。Matthew G. Krebs指出：CTC分析技术可以用于评估肿瘤异质性和疾病进程，在治疗过程中，身体中占支配地位的CTC是不断变化的，伴随治疗耐药的出现，耐药性CTC逐渐在治疗后增多。CTC的分析可以通过动态监测肿瘤细胞的变化，实时、动态的反映患者的治疗状况及疾病进程，为目前的肿瘤治疗监测提供很好的补充。

2.CTC培养用于药物敏感性试验

哈佛医学院的研究人员发表在science上发表的一项研究，研究通过体外培养循环肿瘤细胞，并将其用于基因测序和药物敏感试验。

哈佛医学院的Daniel Haber从36个患者样本中分离出了CTC细胞，并通过体外培养建立了细胞系。这些细胞系完整的保留了原始的细胞形态和特征，动物试验显示这5个CTC细胞系中有3个检测到小鼠致瘤。

研究人员药物敏感性试验发现CTC药物敏感性测量结果与临床病史一致，包括紫杉醇和卡培他滨的敏感性、氟维司群和阿霉素的耐药性。随着CTC培养条件的优化，这个策略可以帮助恶性肿瘤患者在整个疾病过程中接受最好的治疗。

3.循环肿瘤胞团

由哈佛大学完成的一项关于循环肿瘤细胞团的研究发表在cell，该项研究中研究人员通过示踪标记乳腺肿瘤的小鼠模型，发现CTC细胞团是由单克隆肿瘤细胞群形成而不是在血液循环中聚集形成。虽然血液中CTC细胞团相对单个CTC而言较为稀少，但是其形成转移的潜能是单个CTC的20~50倍。该项研究说明循环肿瘤细胞团有更大的转移潜能，是单个CTC转移潜能的20~50倍。

4.CTC表型和核型分析的临床意义

由北京大学肿瘤医院完成的一项关于循环肿瘤细胞表型和核型分析的研究发表在Oncotarget，研究人员通过阴性富集技术结荧光原位杂交技术检测CTC，进一步分析胃癌CTC中人表皮生长因子受体（HER2）表达及8号染色体非整倍体。

该项研究结果显示CTC水平的HER2检测与靶向治疗用药相关，CTC核型分析表明8号染色体不同倍体对于紫杉醇、顺铂化疗敏感或耐药存在相关性。根据CTC 8号染色体核型或者HER2 表达可以监测胃癌患者化疗耐药以及评估治疗疗效。

lbasome

我觉得现在做CTC的有个问题是，对于早期病人来说，CTC的含量是很低的，而极低的CTC检测也就更有意义。那么与CTC检测相联系的就是单细胞的分析，因此单细胞分析技术的发展会成为CTC检测的一个重要的技术。